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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2824 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Um zu untersuchen, wie natürliche Allelvariation die quantitative Variation des Entwicklungssystems erklärt, haben wir natürliche Unterschiede in der Nischenaktivität von Keimstammzellen, gemessen als Größe der Vorläuferzone (PZ), zwischen zwei Caenorhabditis elegans-Isolaten charakterisiert. Die Kopplungskartierung ergab Kandidatenloci auf den Chromosomen II und V, und wir fanden heraus, dass das Isolat mit einer kleineren PZ-Größe eine 148 bp große Promotordeletion im Notch-Liganden, lag-2/Delta, aufweist, einem zentralen Signal, das das Schicksal von Keimstammzellen fördert. Wie vorhergesagt, führte die Einführung dieser Deletion in das Isolat mit einer großen PZ zu einer kleineren PZ-Größe. Unerwarteterweise führte die Wiederherstellung der gelöschten Ahnensequenz im Isolat mit einer kleineren PZ nicht zu einer Vergrößerung, sondern zu einer weiteren Verringerung der PZ-Größe. Diese scheinbar widersprüchlichen phänotypischen Effekte werden durch epistatische Wechselwirkungen zwischen dem Lag-2/Delta-Promotor, dem Chromosom-II-Locus und weiteren Hintergrund-Loci erklärt. Diese Ergebnisse liefern erste Einblicke in die quantitative genetische Architektur, die ein tierisches Stammzellsystem reguliert.

Die Feinabstimmung der Zellproliferation ist ein grundlegender Aspekt der Organismusentwicklung und der Gewebehomöostase, die oft durch Stammzellnischen koordiniert wird. Selbst kleine Störungen in der Nischenaktivität von Stammzellen können das Gewebewachstum und die Gewebeerhaltung beeinträchtigen und zu Pathologien führen1. Die Untersuchung der molekulargenetischen Mechanismen, die die Aktivität von Stammzellnischen regulieren, ist daher zu einem Hauptschwerpunkt der biologischen Forschung geworden. Während entwicklungsgenetische Studien zur Nischenfunktion von Stammzellen bei Tieren die zugrunde liegenden wichtigen molekularen Regulationsmechanismen entschlüsselt haben, bleibt die Frage, ob und wie die Aktivität von Stammzellsystemen durch genetische Variationen in natürlichen Populationen moduliert wird, weitgehend unbeantwortet. Wie trägt eine solche allelische Variation, falls vorhanden, zur Variation der Nischenaktivität von Stammzellen bei? Beherbergen bekannte Gene, die an der Nischensignalisierung von Stammzellen beteiligt sind, diese Variation? Und inwieweit kann die natürliche Variation der Nischenaktivität von Stammzellen durch die Auswirkungen einzelner genetischer Varianten mit großer Wirkung im Vergleich zu polygenen Beiträgen von Varianten mit geringer Wirkung erklärt werden? Die meisten quantitativen Merkmale sind komplex und beinhalten eine polygene Architektur, wobei genetische Varianten nicht nur additiv, sondern auch interaktiv wirken. Eine solche Epistase, auch Gen-Gen-Wechselwirkungen (G x G) genannt, entspricht nichtadditiven Wechselwirkungen zwischen Allelvarianten an verschiedenen Genomorten2. Für die meisten quantitativen Phänotypen verschiedener Taxa wurde eine starke Polygenität und Epistase beobachtet3,4,5,6,7,8, eine detaillierte mechanistische Analyse komplexer epistatischer Wechselwirkungen, einschließlich Epistase höherer Ordnung, bei der drei oder mehr Loci interagieren, bleibt jedoch selten9,10 ,11,12,13,14,15. Obwohl experimentell schwierig zu charakterisieren, deuten molekulare und quantitative genetische Analysen auch darauf hin, dass weit verbreitete epistatische Interaktionen den Entwicklungsphänotypen zugrunde liegen15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Bisher gibt es jedoch keine Informationen darüber, wie Wechselwirkungen zwischen natürlichen Allelen zu quantitativen Variationen in tierischen Stammzellsystemen führen.

Keimbahnstammzellsysteme (GSC) sind für die Entwicklung und Fortpflanzung von Metazoen von grundlegender Bedeutung, da sie unsterbliche Keimzellpopulationen in einem undifferenzierten Zustand halten und genetische und umweltbedingte Hinweise integrieren, um die Produktion von Keimzellvorläufern anzupassen1,25,26. Genetische Forschung und vergleichende Evo-Devo-Studien haben eine Vielfalt von GSC-Systemen in entfernten Taxa aufgedeckt27,28,29, aber ob die Aktivitäten dieser Systeme in natürlichen Populationen derselben Art quantitative Unterschiede aufweisen, ist derzeit nicht bekannt. Genomische und entwicklungsgenetische Analysen eng verwandter Arten (z. B. innerhalb der Gattung Drosophila oder der Nematodengattung Caenorhabditis) zeigen, dass Hauptmerkmale der GSC-Nische, wie die wichtigsten molekularen Signalwege und Zell-Zell-Interaktionen, innerhalb der Gattungen weitgehend konserviert sind30, 31,32,33,34. Populationsgenetische Studien in Drosophila zeigen jedoch, dass zentrale GSC-Gene auch innerhalb von Arten überraschend hohe Allelvariationen aufweisen können, was darauf hindeutet, dass sich diese Gene aufgrund positiver Selektion schnell und häufig entwickeln35,36,37. Trotz ihrer Bedeutung für einen grundlegenden Entwicklungsprozess scheinen regulatorische Gene von GSC-Nischen daher nicht evolutionär eingeschränkt zu sein. Unklar bleibt, wie sich die beobachtete natürliche Allelvariation in phänotypische Variationen wie die GSC-Nischenaktivität niederschlägt.

Um die genetische Grundlage der natürlichen quantitativen Variation der GSC-Nischenaktivität zu untersuchen, verwenden wir das GSC-System in C. elegans, das als einfaches In-vivo-System zur Untersuchung der Nischenfunktion von Stammzellen diente und eine Reihe genau definierter molekularer Signalwege umfasst25 ,38,39. Die hermaphroditische Keimbahn von C. elegans besteht aus zwei symmetrischen Armen mit distalen Keimzell-Vorläuferzonen (PZ), auch mitotische oder proliferative Zonen genannt, die die Stammzellen sowie Vorläuferzellen in der Mitose- und meiotischen S-Phase umfassen (Abb. 1a). . Keimzellen differenzieren sich über meiotische Stadien zu Gametenvorläufern, während sie sich dem proximalen Ende des Arms nähern (Abb. 1a, b)25,38. Die wichtigsten regulatorischen Signale werden von der Distal Tip Cell (DTC) ausgedrückt, einer somatischen Gonadenzelle, die Zellen im PZ abdeckt und kontaktiert (Abb. 1a). Bei diesen Signalen handelt es sich um die Liganden Delta/Serrate/LAG-2 (DSL-Familie), LAG-2 und APX-1, die Notch (GLP-1)-Rezeptoren in distalen Keimzellen aktivieren, das Schicksal der Stammzellen fördern und den Eintritt in die Meiose hemmen40 ,41,42,43,44,45,46. Das DTC stellt somit eine Stammzellnische dar25. Die GLP-1/Notch-Signalisierung ist für die Aufrechterhaltung des Keimstammzellpools notwendig und ausreichend25,39. Keimzellen treten zunehmend in die Meiose ein, wenn sie sich proximal bewegen und den Kontakt zum DTC verlieren. Dies wird durch ein Netzwerk von RNA-Regulationsproteinen gesteuert, darunter PUF-RNA-Bindungsproteine ​​(Pumilio und FBF), die die Selbsterneuerung stromabwärts von GLP-1/Notch und anderen RNA-Regulationsproteinen (GLD-1, GLD-2, SCFPROM-1) fördern ), die den Eintritt in die Meiose fördern25,38,39,47,48,49. Zusätzliche Signale von Gonadenscheidenzellen modulieren die Keimzellproliferation und -differenzierung von C. elegans weiter50,51,52,53,54,55,56. Die Anzahl der Keimbahn-PZ-Zellen wird somit durch das Zusammenspiel der distalen proliferativen Aktivität und des räumlich-zeitlichen Übergangs in den proximalen meiotischen Zustand bestimmt. Darüber hinaus reagiert die proliferative Aktivität der Keimbahn von C. elegans sehr empfindlich auf Variationen in der Physiologie und der äußeren Umgebung und reagiert unterschiedlich auf die Qualität und Quantität der Nährstoffe, die Temperatur oder das soziale Umfeld25,32,57,58,59,60,61. Umweltvariationen modulieren die GSC-Proliferation über metabolische und sensorische Signalwege (z. B. TGF-β, TOR, AMPK und Insulin), die sowohl abhängig als auch unabhängig von nischenvermittelten Delta/Notch-Signalen wirken62,63,64,65,66,67, 68. Das Keimstammzellsystem von C. elegans ist daher äußerst plastisch und in der Lage, seine Aktivität als Reaktion auf subtile Umweltveränderungen fein abzustimmen. Ob natürliche genetische Variation die Aktivität dieses Stammzellsystems in ähnlicher Weise modulieren kann, ist nicht bekannt. Frühere Berichte deuten jedoch darauf hin, dass die Größe des Keimbahn-Vorläuferpools nicht nur zwischen verschiedenen Caenorhabditis-Arten, sondern auch zwischen verschiedenen C. elegans-Wildisolaten variiert32,69.

a Die Keimbahn-Vorläuferzone (PZ), die sich am distalen Ende jedes Gonadenarms befindet, enthält sich mitotisch teilende Stamm- und Vorläuferzellen. Der Keimstammzellpool (GSC) wird durch Delta/Notch-Signalisierung durch die somatische Distal Tip Cell (DTC) aufrechterhalten, die distale PZ-Zellen umhüllt. Die Liganden Delta/Serrate/LAG-2 (DSL-Familie), LAG-2 und APX-1, aktivieren Notch (GLP-1) in Keimzellen, um die Proliferation zu fördern und gleichzeitig den meiotischen Eintritt zu verhindern. Keimzellen differenzieren sich über meiotische Stadien zu Gametenvorläufern, während sie sich dem proximalen Ende des Arms nähern. b Die PZ-Größe wurde als Proxy für die PZ-Zellenzahl verwendet. Mit DAPI gefärbte Ganzwürmer wurden unter Epifluoreszenz abgebildet. Die PZ-Grenze (gepunktete Linie) wurde wie zuvor beschrieben anhand der Form der Keimzellkerne identifiziert. b' Die PZ-Region wurde in ImageJ manuell von anderen Geweben abgeschnitten. b" Der PZ-Bereich wurde mithilfe eines Fluoreszenzschwellenwerts vom Hintergrund segmentiert. Der PZ-Bereich wurde in Pixeln gemessen. Maßstabsbalken 20 μm. c Der auf diese Weise gemessene PZ-Bereich (skaliert auf PZ-Größe – μm2/1000) korreliert gut mit dem handgezählten PZ Zellzahl. Die Daten wurden aus Messungen der beiden Isolate JU1200 und JU751 in zwei Erwachsenenstadien erhalten: Mitte L4 + 24 Stunden und junge Erwachsene + 24 Stunden. Jeder Datenpunkt stellt ein Individuum dar (lineares Modell adj R2 = 0,758, p < 2,2). E-16, n = 87); das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. d PZ-Größe (μm2/1000) bei jungen erwachsenen Hermaphroditen (1–10 Eier in der Gebärmutter) ausgewählter Wildisolate von C. elegans und C. briggsae Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler dar, die aus einem verallgemeinerten linearen Modell abgeleitet wurden. Kleinbuchstaben weisen auf signifikante (p < 0,05) Tukey-bereinigte paarweise Kontraste hin: Isolate mit denselben Buchstaben weisen keinen signifikanten Unterschied in der PZ-Größe auf . n-Werte über zwei Blöcke hinweg werden über der x-Achse angezeigt. e Geografische Herkunft der untersuchten Wildisolate; Karten, die mit den R-Paketen rnaturalearth und rnaturalearthdata v. 0.1.0112 und rgeos v. 0.5-9113 erstellt wurden. Daten und statistische Ergebnisse finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 1 und 2 sowie in der Quelldatendatei.

In dieser Studie wollten wir die natürliche Variation der Nischenaktivität von Keimstammzellen von C. elegans quantifizieren und genetisch charakterisieren. Wir zeigen, dass die Größe der Keimbahn-Vorläuferzone (PZ) – hier ein Indikator für die Nischenaktivität von Keimstammzellen – zwischen genetisch und geografisch unterschiedlichen Wildisolaten unter identischen Standardlaborbedingungen unterschiedlich ist. Wir verwendeten einen Linkage-Mapping-Ansatz, um genomische Regionen zu identifizieren, die mit natürlichen Variationen der PZ-Größe verbunden sind, und konzentrierten uns dabei auf zwei Wildisolate mit ausgeprägten Unterschieden in der PZ-Größe. Die genetische Kartierung ergab vier QTL-Kandidaten, darunter zwei Loci mit großem Effekt auf den Chromosomen II und V, die additiv wirken und etwa 32 % der Variation der PZ-Größe zwischen den Linien unseres Kartierungspanels erklären. Wir entdeckten, dass die QTL-Region auf Chromosom V eine INDEL-Variante in der Promotorregion des DSL-Liganden lag-2 beherbergt, die ursächlich zur Variation der PZ-Größe beiträgt. Wir haben jedoch auch herausgefunden, dass die phänotypischen Effekte dieser Variante durch epistatische Interaktionen mit dem QTL auf Chromosom II und weiteren, unbekannten Genomorten stark moduliert werden. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass komplexe epistatische Interaktionen einen wichtigen Beitrag zur natürlichen Variation der Nischenaktivität von Keimstammzellen leisten und erste Einblicke in die quantitative genetische Architektur eines tierischen Stammzellsystems liefern.

Unter Standardlaborbedingungen enthält die hermaphroditische Keimbahn-Vorläuferzone (PZ) des Referenz-Wildtyp-Stamms C. elegans (N2) im frühen Erwachsenenalter typischerweise etwa 250 Zellen25. Die Bildgebung des gesamten PZ und die Zählung der Gesamtzahl der Keimzellen ist zeitaufwändig und für das Screening einer großen Anzahl von Stämmen ineffizient. Um natürliche Unterschiede in der PZ-Größe zwischen mehreren Wildisolaten von Caenorhabditis zu quantifizieren, haben wir zunächst eine Methode zur Annäherung an die PZ-Größe entwickelt, indem wir die Querschnittsfläche des PZ in einem einzelnen Fluoreszenzbild einer DAPI-gefärbten Gonade im gesamten Mount quantifizierten (Abb. 1b). Mit dieser Methode abgeleitete PZ-Messungen korrelierten gut mit der individuellen Anzahl von PZ-Kernen aus Bildstapeln im gesamten PZ (adj. R2 = 0,758, p <2,2E-16) (Abb. 1c, Ergänzende Anmerkung 1). Wir untersuchten mehrere Wildisolate von C. elegans und C. briggsae aus der ganzen Welt und entdeckten bei Messungen unter Standardlaborbedingungen signifikante inter- und intraspezifische Unterschiede in der PZ-Größe (Abb. 1d, Ergänzende Anmerkung 2). Die allgemeine Erblichkeit der PZ-Größe junger Erwachsener im Datensatz wurde auf 28 % geschätzt (Ergänzende Anmerkung 2d).

Unter den untersuchten Wildisolaten zeigten JU1200 (Schottland) und JU751 (Frankreich) signifikante und gut reproduzierbare Unterschiede. JU1200 weist eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Laborreferenzstamm N270 auf. Als junge erwachsene Hermaphroditen wies JU1200 durchweg mehr Vorläuferzellen auf als JU751 (Abb. 1d). Wir haben die PZ-Zellzahl in diesen beiden Isolaten vom späten Larvenstadium bis zum reproduktiven Erwachsenenstadium untersucht. Während sich die PZ-Zellzahl im mittleren L4-Stadium nicht unterschied, zeigte JU751 in zwei Stadien des frühen Erwachsenenalters eine signifikant verringerte PZ-Zellzahl im Vergleich zu JU1200 (Abb. 2a, Ergänzende Anmerkung 3).

a Anzahl der PZ-Kerne in vier Entwicklungsstadien: Larve im mittleren L4-Bereich (mL4), junges adultes Tier (YA) mit 1–10 Eiern in der Gebärmutter, adultes Tier 24 Stunden nach mittlerem L4-Stadium (mL4 + 24 h) und adultes Tier im Alter von 24 Jahren Stunden nach dem jungen Erwachsenenalter (YA + 24 h). Die Kerne wurden in Z-Stapeln extrudierter DAPI-gefärbter Gonaden gezählt. Kleinbuchstaben weisen auf signifikante Tukey-bereinigte paarweise Kontraste hin (p < 0,05), sodass sich Gruppen mit denselben Buchstaben nicht signifikant unterscheiden. Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler dar, die aus einem verallgemeinerten linearen Modell abgeleitet wurden. Die n-Werte für jeden Stamm und jedes Stadium sind unterhalb der x-Achse angegeben (JU1200 = rot, JU751 = blau). b Anzahl der EdU+ (positiven) Kerne im PZ nach einem 15-minütigen EdU-Puls im mittleren L4-Stadium ( ***p = 0,00005, Tukey-bereinigter paarweiser Kontrast). n-Werte werden unterhalb der x-Achse angezeigt. Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler dar, die aus einem verallgemeinerten linearen Modell abgeleitet wurden. c Repräsentative Bilder der PZ in Whole-Mount-DAPI-gefärbten Würmern bei ml4 + 24 h. Maßstabsbalken: 20 μm. d Repräsentative Bilder der EdU-Färbung im mittleren L4-Stadium. Gepunktete Linien markieren die proximale Grenze des PZ. Maßstabsbalken: 20 μm. Es werden Daten aus einem einzelnen (von zwei) Versuchsblöcken angezeigt. Daten und statistische Ergebnisse finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 3 und 4 sowie in der Quelldatendatei.

Da die PZ-Größe möglicherweise nicht nur durch die proliferative Aktivität, sondern auch durch die Übergangsrate zum meiotischen Schicksal beeinflusst wird, haben wir die mitotische Aktivität mithilfe eines 15-minütigen EdU-Pulses (5-Ethinyl-2-desoxyuridin) getestet, um die Proliferation direkt zu markieren und zu quantifizieren die PZ vor dem Erwachsenenstadium. Im mittleren L4-Stadium, als sich die PZ-Zellzahlen in JU751 und JU1200 nicht signifikant unterschieden (Abb. 2a), wies JU751 eine deutlich geringere Anzahl EdU-positiver Zellen und damit eine geringere Keimzellproliferationsaktivität auf als JU1200 (Abb. 2b, Ergänzende Anmerkung 4). Unterschiede in der Keimzellproliferation tragen somit zum beobachteten Unterschied in der PZ-Größe zwischen JU751 und JU1200 bei.

Um die genetische Architektur zu charakterisieren, die den beobachteten Unterschieden in der PZ-Größe zwischen JU751 und JU1200 zugrunde liegt, führten wir eine QTL-Verknüpfungskartierung (Quantitative Trait Locus) unter Verwendung vorhandener rekombinanter F2-Inzuchtlinien (RILs) durch, die aus diesen beiden Isolaten abgeleitet wurden (Abb. 3a, b)71. Die RILs wurden durch Selfing von F1-Hermaphroditen aus reziproken Elternkreuzungen und Inzucht der F2-Linien über zwölf Generationen hinweg konstruiert, um eine Reihe von Linien zu erzeugen, die an jedem Ort für einen der beiden Elterngenotypen homozygot sind (Abb. 3b)71. Wir haben die PZ-Größe junger erwachsener Hermaphroditen (1–10 Eier in der Gebärmutter) in 70 RILs gemessen und die phänotypischen Unterschiede auf einer genetischen Karte abgebildet, die aus den Rekombinationshäufigkeiten von 140 SNP-Markern im gesamten Genom abgeleitet wurde (Abb. 3a, ergänzende Abb. 1). ). Die PZ-Größe variierte kontinuierlich zwischen den RILs und zeigte eine transgressive Segregation (dh extreme Phänotypen, die die elterlichen Phänotypen übertrafen) (Abb. 3a). Wir verwendeten daher einen Multi-QTL-Modellierungsansatz unter Verwendung des R-Pakets R/qtl72. Als ersten Schritt führten wir einen einzelnen QTL-Scan durch, einen Algorithmus, der die Wahrscheinlichkeit berechnet, dass der Genotyp an einem einzelnen Ort die Phänotypdaten erklären kann. Dieser Scan ergab einen Locus mit großem Effekt im Zentrum von Chromosom II (QII) mit einem 1,5-LOD-Intervall von ~7,25 MB (Abb. 3c, grüne Linie). Als nächstes verwendeten wir einen Zwei-QTL-Algorithmus, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass ein Loci-Paar mit dem Phänotyp assoziiert ist. Wichtig ist, dass dieser Algorithmus nicht zulässt, dass die Loci gegensätzliche Effekte haben. Der Zwei-QTL-Scan ergab einen zusätzlichen Locus (QV) auf dem linken Arm von Chromosom V (~ 2,6 MB), der additiv mit dem QII-QTL auf Chromosom II wirkt (Abb. 3d – f). Die Einzel-QTL-Kartierung mit dem QII-QTL als additiver Kovariate ergab auch den QV-QTL auf Chromosom V (Abb. 3c, magentafarbene Linie). Ein zusätzlicher Zwei-QTL-Scan, der insbesondere Wechselwirkungen zwischen Loci mit gegensätzlichen Effekten berücksichtigt, ergab zwei weitere potenzielle QTL auf den Chromosomen I (QI, ~1 Mb) und X (QX, ~2,7 Mb) (Abb. 3g – i). Anschließend führten wir eine Multi-QTL-Modellauswahl durch und verwendeten diese vier Loci als Kandidaten. Wir haben die Modellauswahl manuell durchgeführt und auch ein in R/qtl bereitgestelltes Modellerstellungs- und Bereinigungstool verwendet. Dieser Algorithmus beginnt naiv oder mit einem bestimmten Modell, indem er durch aufeinanderfolgende Genomscans Loci hinzufügt und jedem Modell einen bestraften LOD-Score zuweist. Anschließend wird das Modell bereinigt, um die einfachste Form mit dem höchsten abgestraften LOD-Score zu erhalten (LOD > 0 bedeutet, dass das Modell eine bessere Leistung erbringt als ein Modell mit einem QTL von Null). Ein repräsentativer Satz aller getesteten Modelle zusammen mit ihren abgestraften LOD-Werten ist in Abb. 3j dargestellt. Wir haben beide Ansätze verwendet und festgestellt, dass unsere RIL-Daten ein Modell am besten unterstützen, bei dem QII und QV additiv wirken, um die PZ-Größe zu bestimmen. Dieses Modell erklärte ~32 % der phänotypischen Variation in den RIL-Daten (Ergänzende Anmerkung 6).

a PZ-Größenschätzungen (korrigiert) in F2-RILs (n = 70, getestet über sechs experimentelle Blöcke) und Elternlinien JU1200 (rot) und JU751 (blau) (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 5). b Generierung und Analyse von F2-RILs. Gepunktete Linie: hypothetischer QTL. c Single-QTL-Scans identifizieren zwei QTL (QII und QV). Horizontale Linien: LOD-Schwellenwert basierend auf Permutationstests. x-Achse: genetische Karte für jedes Chromosom. Grüne Linie: naive Scan-Ergebnisse. Magenta-Linie: Ergebnisse eines Scans, bei dem Marker M13 (Peak, Magenta-Kurve) als Kovariate enthalten ist. d Ergebnisse des Zwei-QTL-Scans. Obere Hälfte: LOD-Werte (LODa) beim Vergleich des additiven Modells mit dem Nullmodell. Untere Hälfte: LOD-Scores beim Vergleich des additiven mit dem Single-QTL-Modell (LODav1). LODav1-Werte über dem Schwellenwert (weiß, bestimmt durch Permutationstests) weisen auf eine Verbesserung der Anpassung gegenüber dem Einzel-QTL-Modell hin. e Interaktionsdiagramm für Marker im Peak in Panel D, untere Hälfte (chr V, M1; chr II, M14). f Ungefähre Positionen und Größen der QTL auf II und V. g Zwei-QTL-Scan, der gegensätzliche Effekte ermöglicht. Obere Hälfte: LOD-Scores (LODi) beim Vergleich eines vollständigen Zwei-QTL-Modells mit dem additiven Modell. Untere Hälfte: LOD-Werte beim Vergleich des vollständigen Modells (unter Berücksichtigung von Interaktionen) mit dem Einzel-QTL-Modell (LODfv1). LODi-Scores über dem Schwellenwert (weiß) weisen auf Hinweise auf eine Interaktion hin, während LODfv1-Scores über dem Schwellenwert auf eine Verbesserung der Anpassung gegenüber dem Single-QTL-Modell hinweisen. h Interaktionsdiagramm für Marker im signifikanten Peak in der oberen Hälfte von Panel G (chr I, M14 und chr X, M2). i Ungefähre Positionen und Größen der QTL-Kandidaten auf den Chromosomen I und X. j Darstellung der Multi-QTL-Modellauswahl. Knoten repräsentieren Kandidaten-QTL (QII = chrII@35 cM, QV = chr V@0 cM, QI = chrI@23 cM, QXa = chrX@16 cM, QXb = chrX@2,5 cM) und Speichen stellen Interaktionen dar. Bestrafte LOD-Werte (unter jedem Modell) über Null weisen auf eine bessere Leistung als der globale Nullwert (QTL von Null) hin. Weitere Einzelheiten finden Sie in den Methoden, der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Anmerkung 6. Die Y-Achsen in den Feldern a, e und h sind auf μm2/1000 (0,1008 μm2/Pixel) skaliert. Die Daten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Wirkung des Chromosom-II-QTL (QII) auf die PZ-Größe zu validieren, haben wir nahezu isogene Linien (NILs) generiert. Zwei RILs, die die JU751-Sequenz in QII enthielten, wurden 10 Generationen lang mit JU1200 rückgekreuzt, um zwei NILs zu erzeugen, die die JU1200-Sequenz in verschiedenen Segmenten des QTL enthielten (Abb. 4a). Zwei RILs, die die JU1200-Sequenz in QII enthielten, wurden 10 Generationen lang mit JU751 rückgekreuzt, um fünf NILs zu erzeugen, die die JU1200-Sequenz in verschiedenen Segmenten des QTL enthielten (Abb. 4b). NILs wurden durch Selektion auf das Vorhandensein elternspezifischer PCR-Produkte in der QTL-Region generiert. Wir haben die PZ-Größe in jedem der NILs mehrmals getestet. Die im JU1200-Hintergrund etablierten NILs zeigten subtile Auswirkungen auf die PZ-Größe, die über experimentelle Tests (Blöcke) hinweg nicht immer konsistent waren. Wir haben daher die aggregierten Ergebnisse aus neun Blöcken mithilfe verallgemeinerter linearer Modelle analysiert, um den experimentellen Blockeffekt zu berücksichtigen, und festgestellt, dass wir eine kleine, aber signifikante Verringerung der PZ-Größe feststellen konnten (Abb. 4c, Ergänzende Anmerkung 7). Die NILs im JU751-Hintergrund zeigten größere und konsistentere Unterschiede in der PZ-Größe, was die Auswirkung von QII auf die PZ-Größe bestätigt (Abb. 4d, Ergänzende Anmerkung 8). Darüber hinaus ermöglichten uns Rekombinationsereignisse, die während des Rückkreuzungsverfahrens aufgetreten waren, die Eingrenzung der QTL-Region von 7,25 Mb auf 2,04 Mb (Abb. 4b). Bei der Suche nach JU751-JU1200-Polymorphismen in dieser reduzierten Genomregion wurden insgesamt ~1024 Varianten entdeckt (einschließlich 196 potenzielle Varianten mit hoher Auswirkung, d. h. Varianten, von denen ein BCSQ-Algorithmus vorhersagte, dass sie wahrscheinlich die Genfunktion verändern, beispielsweise durch Frameshift oder Nonsense-Mutationen). in 250 verschiedenen Genen und 10 großen INDELs70 (Einzelheiten siehe Quelldaten). Wir haben jedoch keine starken Kandidatenvarianten für eine weitere Analyse identifiziert.

a Erzeugung nahezu isogener Linien (NILs) im JU1200-Hintergrund. Diagramm, das das ursprüngliche QII-QTL-Intervall von ~7,25 MB auf Chromosom II zeigt, wobei die gestrichelte vertikale Linie die ungefähre Position des LOD-Peaks angibt. Zwei RILs, RIL54 (Stamm NIC654) und RIL127 (Stamm NIC727), die die JU751-Sequenz in QII enthielten, wurden über 10 Generationen mit JU1200 rückgekreuzt, um zwei NILs (Stämme NIC1697 und NIC1701) zu produzieren. Blau: JU751-Genotyp, Rot: JU1200-Genotyp. b Generierung von NILs im JU751-Hintergrund. Diagramm, das das ursprüngliche QII-Intervall von ~7,25 MB auf Chromosom II zeigt, wobei die gestrichelte vertikale Linie die ungefähre Position des LOD-Peaks des ursprünglichen QTL anzeigt. Zwei RILs, RIL128 (Stamm NIC728) und RIL71 (Stamm NIC671), die die JU1200-Sequenz in QII enthielten, wurden über 10 Generationen mit JU751 rückgekreuzt, um fünf NILs zu produzieren (Stämme NIC1671, NIC1672, NIC1673, NIC1675 und NIC1676). Blau: JU751-Genotyp, Rot: JU1200-Genotyp. c PZ-Größenmessungen in NILs, die im JU1200-Hintergrund (siehe Abbildung a) und den Elternisolaten etabliert wurden. n-Werte werden über der x-Achse angezeigt. Daten aus neun Versuchsblöcken wurden analysiert. d PZ-Größenmessungen in NILs, die im JU751-Hintergrund (siehe Abbildung b) und den Elternisolaten etabliert wurden. n-Werte werden über der x-Achse angezeigt. Dargestellt sind Daten aus einem einzelnen (von neun) Versuchsblöcken. Das verkürzte QII-Intervall wurde ermittelt, indem gefragt wurde, ob jeder NIL im Vergleich zu JU751 einen signifikanten Anstieg der PZ-Größe aufwies. Alle NILs außer NIC1676 hatten größere PZs als JU751. Daher wurde der Bereich, über den sich das JU1200-Segment in diesen NILs überlappt, als reduziertes QTL-Intervall (2,04 MB) betrachtet. Die Analysen für die in den Feldern c und d gezeigten Daten wurden an Rohdaten (PZ-Fläche in Pixeln) durchgeführt und die y-Achsen wurden zur Darstellung auf μm2/1000 skaliert (0,0504 μm2/Pixel). Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler dar, die aus verallgemeinerten linearen Modellen abgeleitet wurden. p-Werte werden aus Tukey-bereinigten paarweisen Kontrasten abgeleitet. Daten und statistische Ergebnisse finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 7 und 8 sowie in der Quelldatendatei.

Der 2,6-MB-Bereich von QV enthielt nur 21 mutmaßliche Kandidatenvarianten (SNPs und INDELS), die zu PZ-Größenunterschieden zwischen JU751 und JU1200 beitrugen. Die detaillierte Untersuchung dieser Varianten ergab einen Hauptkandidaten: eine Deletion in JU751 stromaufwärts der Genomregion, die den Delta-ähnlichen Liganden Lag-2 kodiert, einen primären Regulator der Keimzellproliferation und -differenzierung im Notch-Signalweg25,70. Wir haben diesen Löschvorgang lag-2(cgb1007) genannt; Genotypen mit dieser Deletion werden ab hier als lag-2p(-) abgekürzt, während wir Genotypen ohne diese Deletion als lag-2p(+) bezeichnen. Diese Deletion erstreckt sich über 148 bp und befindet sich in der Lag-2-Promotorregion, 2.441 bp stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle (Abb. 5a und ergänzende Abb. 2). Die 3,3 kb große Upstream-Promotorregion von Lag-2 enthält sechs HLH-2-Bindungsstellen (E-Boxen), die für eine robuste Lag-2-Transkription im DTC30,73 notwendig sind. Die lag-2(cgb1007)-Deletion enthält eine dieser konservierten HLH-2-Bindungsstellen sowie den größten Teil einer 30-bp-Poly(G)-Wiederholung (Abb. 5a, ergänzende Abb. 2 und 3). Diese Deletion könnte die bei JU751 beobachtete verringerte Keimzellproliferation aufgrund einer verringerten Lag-2-Transkription über den Verlust einer spezifischen Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor HLH-273 erklären.

ein Diagramm des QV-QTL (schwarzer Balken) und einer 5-kb-Region darin, die das lag-2-Gen und seine 3-kb-Upstream-Sequenz enthält. Der gut charakterisierte Lag-2-Promotor enthält mehrere bekannte Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, darunter sechs HLH-2-E-Boxen (dunkelblau)115. JU751 weist eine 148 bp große Deletion (rot) auf, die die dritte HLH-2-Bindungsstelle und den größten Teil einer 30 bp großen PolyG-Wiederholung (orange) überlappt. Die Speicherorte aller Promoterelemente und die UCSC-PhastCons-Statistiken (grün) wurden dem JBrowse-Tool115 von wormbase.org (Version WS283) entnommen. b Die Größe der PZ (μm2/1000) in den Eltern- und Allelersatzlinien (ARLs) im jungen Erwachsenenstadium. Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler aus einem verallgemeinerten linearen Modell dar. Über der x-Achse werden n-Werte über zwei Blöcke hinweg angezeigt. Die Analyse erfolgte anhand der Rohdaten (PZ-Fläche in Pixeln) und die y-Achsen wurden zur Darstellung auf μm2/1000 skaliert (0,0504 μm2/Pixel). c Repräsentative Bilder, die für die smFISH-Quantifizierung von Lag-2-Transkripten im DTC in der Mitte von L3 verwendet werden (Lag-2-mRNA grün, DAPI [DNA] weiß, Maßstabsbalken 10 μm). Der Gonadenarm ist durch eine gestrichelte Linie umrissen. Der Pfeil markiert den Fehlercode. c' Stärkere Vergrößerung des DTC-Bereichs von c. Der Pfeil zeigt den Fehlercode an. Pfeilspitzen zeigen einzelne Puncta an, die quantifiziert wurden, um die Lag-2-Expressionsniveaus zu bestimmen. d–f Quantifizierung von Lag-2-mRNA-Punkten mittels smFISH. Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler aus einem einzelnen verallgemeinerten linearen Modell dar. Für alle Genotypen gilt n = 19 oder 20 pro Stadium. Die Daten eines einzelnen Experiments wurden der Übersichtlichkeit halber in drei Diagramme aufgeteilt. Gruppen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich signifikant (p < 0,05) gemäß Tukey-bereinigten paarweisen Kontrasten. Daten und statistische Ergebnisse finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 9 und 10 sowie in der Quelldatendatei.

Bei der Untersuchung der gesamten Genomsequenzdaten einer globalen Gruppe von über 1.500 C. elegans-Wildisolaten70,74 stellten wir fest, dass die Deletion lag-2(cgb1007) nur für das Isolat JU751 vorkommt. Eine ähnliche, aber größere Deletion in der Lag-2-Promotorregion wurde in zwei Isolaten aus Asien, GXW1 und JU4073, gefunden (ergänzende Abbildung 3c, d). Da keine anderen Isolate gefunden wurden, die die Deletion lag-2(cgb1007) trugen, fragten wir uns, ob diese Deletion nach der Isolierung während der Laborkultur aufgetreten sein könnte. Wir untersuchten daher zusätzliche Isolate (für die keine Daten zur Gesamtgenomsequenz vorliegen), die 2004 und 2005 aus demselben Lebensraum (Kompost) und demselben Standort (Le Perreux-sur-Marne, Frankreich) wie JU751 gesammelt wurden75. Alle anderen Isolate (n = 5), die zusammen mit JU751 an diesem Ort am selben Tag gesammelt wurden, hatten einen sehr ähnlichen Haplotyp und trugen auch die Deletion lag-2 (cgb1007). Im Gegensatz dazu wiesen alle untersuchten Isolate mit unterschiedlichen Haplotypen, die zu anderen Zeitpunkten in den Jahren 2004 und 2005 gesammelt wurden (n = 13), die Deletion nicht auf71 (ergänzende Abbildung 3). Wir kommen zu dem Schluss, dass die Deletion von lag-2(cgb1007) vor der Isolierung im Labor erworben wurde und dass dieses Allel in natürlichen Populationen wahrscheinlich selten vorkommt.

Um zu bestätigen, dass die Genomregion lag-2 (cgb1007) zu Unterschieden in der Keimbahn-PZ-Größe zwischen JU751 und JU1200 beiträgt, haben wir mithilfe der CRISPR-Cas9-Genombearbeitung reziproke Allelersatzlinien (ARLs) erstellt. Zuerst führten wir die Deletion lag-2(cgb1007) in JU1200 ein, was zum Stamm JU1200lag-2p(-) führte. Zweitens haben wir die gelöschte lag-2-Promotorregion in JU751 wiederhergestellt, was zum Stamm JU751lag-2p(+) führte. Wie vorhergesagt, verringerte das Entfernen des 148-bp-Fragments im JU1200-Hintergrund die PZ-Größe stark (Abb. 5b). Im Gegensatz dazu und entgegen den Erwartungen führte die Wiederherstellung des entsprechenden Fragments im JU751-Hintergrund nicht zu einer Vergrößerung, sondern zu einer weiteren Verringerung der PZ-Größe (Abb. 5b, Ergänzende Anmerkung 9). Obwohl die Deletion von lag-2(cgb1007) ausreicht, um die PZ-Größe in einem ähnlichen Ausmaß wie bei JU751 zu verringern, wenn sie in den JU1200-Hintergrund eingeführt wird, kann sie nicht die einzige genetische Variante sein, die zum beobachteten Unterschied in der PZ-Größe zwischen JU751 und JU1200 beiträgt. Mit anderen Worten: Die Auswirkungen der Deletion von lag-2(cgb1007) hängen stark vom genetischen Hintergrund ab. Dies steht im Einklang mit unserer QTL-Analyse, bei der der marginale Effekt des QV-QTL nur unter Berücksichtigung der Variation beim QII-QTL erkennbar war (Abb. 3c). Darüber hinaus hat Lag-2 (cgb1007) zwar deutliche Auswirkungen auf die PZ-Größe und trägt daher zum Gesamteffekt von QV bei, wir können jedoch andere kausale Varianten innerhalb der QV-QTL-Region nicht ausschließen.

Angesichts des obigen Ergebnisses wollten wir als nächstes direkt bestimmen, ob und wie beobachtete genotypische Unterschiede in der PZ-Größe durch Unterschiede in der Lag-2-Expression erklärt werden können. Mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH)76,77 haben wir Lag-2-Transkripte in den DTCs der Elternisolate und reziproken ARLs JU1200lag-2p(-) und JU751lag-2p(+) quantifiziert. Wir haben die Lag-2-Expression zunächst in Elternisolaten gemessen und festgestellt, dass die Expression während der Larvenentwicklung erheblich höher war als im Erwachsenenstadium, wobei die Expression im frühen L3-Stadium am stärksten war (Ergänzende Abbildung 4, Ergänzende Anmerkung 12). Bei der Quantifizierung der Lag-2-Expression in Elternisolaten und reziproken ARLs über drei Larvenstadien hinweg stellten wir fest, dass JU1200 im frühen L3-Stadium (jedoch nicht in der Mitte von L2 oder in der Mitte von L4) eine signifikant höhere Lag-2-Expression im Vergleich zu JU751 aufwies ( Abb. 5d, Ergänzende Anmerkung 10), im Einklang mit der größeren PZ-Größe. Bemerkenswerterweise wurde die relativ höhere Expression von lag-2 in JU1200 im L3-Stadium in JU1200lag-2p (-) vollständig aufgehoben, das in allen drei Entwicklungsstadien sehr ähnliche Expressionsniveaus wie JU751 aufwies (Abb. 5e, Ergänzende Anmerkung 10). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Ergebnissen überein, die zeigen, dass die E-Boxen des Lag-2-Promotors für eine robuste lag-2::GFP-Transgenexpression während der L3-Stufe73 erforderlich sind. Das Einfügen der 148 bp langen Lag-2-Promotorsequenz in den JU751-Hintergrund führte nicht zu einer höheren Lag-2-Expression bei L3 im Vergleich zu JU751. Stattdessen war die Lag-2-Expression in JU751lag-2p(+) bei L3 niedriger, mit ähnlichen Trends bei den Expressionsänderungen zwischen den Stadien (Abb. 5f, Ergänzende Anmerkung 10). Dieses Ergebnis bestätigte, dass die unerwartete Verringerung der PZ-Größe von JU751lag-2p(+) tatsächlich ursächlich mit einer verringerten Lag-2-Expression zusammenhängt. Insgesamt zeigen diese smFISH-Messungen, dass die Lag-2-Expression (im L3-Stadium) die beobachteten phänotypischen Unterschiede in der PZ-Größe im frühen Erwachsenenstadium genau wiedergibt und bestätigen, dass die Auswirkungen der Lag-2-Deletion (cgb1007) stark von der Genetik abhängen Hintergrund. Die Analyse der Elternisolate zeigt auch, dass natürliche Unterschiede in der Nischenaktivität der Keimstammzellen von C. elegans direkt mit Unterschieden in der Expression einer zentralen Signalkomponente, des Notch-Liganden lag-2, zusammenhängen können.

Angesichts der offensichtlichen epistatischen Wechselwirkungen zwischen der Lag-2-Promotorvariante und dem genetischen Hintergrund haben wir ein umfassenderes Modell erstellt, um zusätzliche Zwei- und Drei-Wege-Wechselwirkungen zwischen 1) zentralen Teilen des in unseren NILs isolierten Chromosom-II-QTL (abgekürzt) zu berücksichtigen C2 zur Unterscheidung vom vollständigen QII-QTL – mit den Genotypen C2-JU1200 oder C2-JU751), 2) die Lag-2-Promotorvariante (abgekürzt C5 – mit den Genotypen lag-2p(+) oder lag-2p(-)), und 3) der genetische Hintergrund (BGND – JU1200 oder JU751). Zu diesem Zweck haben wir einen großen Datensatz erstellt, der alle acht möglichen Genotypkombinationen (mit i bis viii gekennzeichnet) enthält (Abb. 6a). Die Analyse dieses Datensatzes ergab sowohl subtile als auch dramatische Zwei- und Drei-Wege-Interaktionen (Abb. 6b–e). Um diese Daten im Detail zu untersuchen, haben wir ein verallgemeinertes lineares Modell erstellt und dabei eine Top-Down-Modellauswahlstrategie verwendet, um das Bayes'sche Informationskriterium (BIC) und die im Modell berücksichtigte angepasste Abweichung zu optimieren (D2)78 (Ergänzende Anmerkung 11). Das optimierte Modell zeigte, dass die PZ-Größe am besten durch alle drei Haupteffekte und alle ihre Wechselwirkungen (dh vollständig gekreuzt) erklärt werden kann. Darüber hinaus umfasst das Modell einen festen Hauptblockeffekt und Wechselwirkungen, um Variationen zwischen verschiedenen experimentellen Blöcken zu berücksichtigen. Das Modell macht 33,4 % der angepassten Abweichung (D2) aus und passt gut zu den Daten (Restabweichung = 2796,5 auf 2763 df; Pχ2 = 0,324) (Ergänzende Anmerkung 11).

ein Schema, das die Erzeugung der acht Genotypen darstellt, die in der Interaktionsanalyse verwendet werden. Die verschiedenen Genotypen wurden abgeleitet, indem die Deletion lag-2 (cgb1007) in JU1200- und JU751-Hintergrund-NILs entweder erstellt oder ersetzt wurde. Die erfolgreich modifizierten Linien wurden dann mit den Elternlinien rückgekreuzt, um die CRISPR-Modifikationen im Elternhintergrund zu isolieren. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die Genotypen mit i-viii gekennzeichnet. b Geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler der PZ-Größe aus einem verallgemeinerten linearen Modell, das einen Datensatz beschreibt, der alle acht Genotypen enthält. Die Genotypen JU1200 und JU751 werden durch Rot bzw. Blau angezeigt und sind für jeden der Loci und Hintergrund unterhalb des Diagramms angegeben. Querbalken und Fehlerbalken stellen geschätzte Randmittelwerte ± Standardfehler aus einem verallgemeinerten linearen Modell (zweiseitig) dar. Kleinbuchstaben weisen auf signifikante (p < 0,05) Tukey-bereinigte paarweise Kontraste hin, sodass Gruppen, die einen Buchstaben gemeinsam haben, sich nicht signifikant unterscheiden. In den Balken sind die n-Werte über sechs Blöcke für jeden Genotyp angegeben. c–e Die gleichen modellabgeleiteten Mittelwerte ± Standardfehler wie in Tafel b werden dargestellt, um die Wechselwirkungen zwischen den Loci und dem Hintergrund zu zeigen. Diagramme mit schwarzen Achsen zeigen nur wechselseitige Wechselwirkungen. Die dritte Dimension wird als Aufteilung in zwei Diagramme dargestellt, wobei die roten und blauen Achsen die Genotypen für den unten links angegebenen Ort angeben. Die p-Werte der bidirektionalen Interaktion sind in den Diagrammen angegeben. Die Analysen wurden an Rohdaten (PZ-Fläche in Pixeln) durchgeführt, die y-Achsen wurden jedoch zur Darstellung auf μm2 skaliert (0,0504 μm2/Pixel) (siehe Ergänzende Anmerkung 11 für Modelldetails). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zur Interpretation des Modells ist es hilfreich, die geschätzten Grenzmittelwerte zu vergleichen (Abb. 6b, Ergänzende Anmerkung 11b). Die Untersuchung der genetischen Wechselwirkungen der beiden Loci und des genetischen Hintergrunds zeigt eine weit verbreitete und starke Epistase, die die Variation in der PZ-Größe erklärt. Wie bereits erwähnt (Abb. 5b), hat die Deletion von lag-2 (cgb1007) je nach genetischem Hintergrund gegensätzliche phänotypische Auswirkungen: Die Deletion verringert die PZ-Größe in JU1200 stark, erhöht jedoch die PZ-Größe in JU751 (Abb. 6b). Die Untersuchung der epistatischen Wechselwirkungen zeigt, dass die Auswirkungen der Lag-2-Variante (cgb1007) stark von C2 und dem genetischen Hintergrund abhängen, sodass die Lag-2-Deletion negative, positive oder keine phänotypischen Konsequenzen für alle Genotypen haben kann (Abb . 6b–e). Ebenso hängen die phänotypischen Effekte von C2 stark vom genetischen Kontext ab: C2-JU751 reduziert die PZ-Größe in jedem Genotyp (Abb. 6b – i vs. ii, v vs. vii und vi vs. viii), mit Ausnahme von JU1200C5-lag- 2p(-) (Abb. 6b – iii vs. iv). Das Vorhandensein der Lag-2-Deletion dämpft die Wirkung von C2-JU751 im JU1200-Hintergrund (Abb. 6e' und e"), was darauf hindeuten könnte, dass Allele innerhalb von C2 zumindest teilweise über diese Region des Lag-2 wirken. 2-Promotor. Wie zu erwarten ist, hat der kombinierte Effekt aller anderen nicht identifizierten Varianten im genetischen Hintergrund insgesamt den größten Einfluss auf die PZ-Größe. Dieser Effekt variiert jedoch erheblich, abhängig vom Vorhandensein einer Lag-2p-Deletion und den Genotypen an C2. Im Allgemeinen reduziert der JU751-Hintergrund die PZ-Größe stark (Abb. 6c' und c"), aber es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen JU1200C2-JU1200 und JU751C2-JU1200, wenn die Lag-2-Deletion vorhanden ist (Abb. 6b – iv vs. v, Abb. 6c'). Wir interpretieren dies so, dass C2-JU1200-Varianten bei Vorhandensein der Lag-2-Deletion (lag-2p(-)) einen starken positiven Effekt auf die Aufrechterhaltung der PZ-Größe ausüben, trotz des durchschnittlichen negativen Effekts von Varianten im JU751-Hintergrund (Abb . 6d“, rote Linie). Umgekehrt können C2-JU751-Varianten diesen positiven Effekt nicht aufrechterhalten, was zu einer Hintergrundempfindlichkeit führt (Abb. 6d“, blaue Linie). Schließlich verändern die C2-JU751-Varianten ohne die Lag-2p-Deletion (lag-2p(+)) nicht den starken negativen Effekt des JU751-Hintergrunds (Abb. 6d‘ vs. Abb. 6d „rote Linien“).

Unser Modell zeigt, dass epistatische Wechselwirkungen höherer Ordnung zur Variation der PZ-Größe von C. elegans beitragen. Wichtig ist, dass einige der beobachteten phänotypischen Effekte maskiert werden, wenn nur bidirektionale Wechselwirkungen berücksichtigt werden (z. B. Abb. 6e vs. e' und e"). Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit von Vorsicht bei der Interpretation des phänotypischen Effekts einer Variante oder Allel, da der Effekt stark von anderen Varianten im genetischen Hintergrund abhängen kann. Wir betonen außerdem, dass selbst unsere Interpretationen der Auswirkungen von C2 und des genetischen Hintergrunds mit Vorsicht betrachtet werden müssen, da es sich um aggregierte Effekte handelt, die durch zugrunde liegende Faktoren beeinflusst werden können epistatische Wechselwirkungen und möglicherweise additive Effekte eng verbundener Loci.

Unsere Studie untersucht die natürliche Variation und quantitative genetische Architektur eines Keimstammzellsystems. Bei der Untersuchung nur einer Handvoll wilder C. elegans-Isolate konnten wir signifikante Unterschiede in der Größe der Keimbahn-Vorläuferzone (PZ) feststellen, was auf eine Variation in der Nischenaktivität der Keimstammzellen hinweist. Unsere Hauptergebnisse sind: (1) Die natürliche Variation der PZ zwischen zwei Isolaten lässt sich auf mehrere, teilweise interagierende QTL übertragen. (2) Ein QTL auf Chromosom V enthält eine für JU751 einzigartige Deletion in der Promotorregion des DSL-Liganden lag-2, einem bekannten Schlüsselsignal, das das Schicksal der Keimstammzellen über den Notch-Weg fördert. (3) Die natürliche quantitative Variation der Keimbahnproliferationsaktivität von C. elegans entsteht durch Modulation der Transkriptionsaktivität zentraler Signalelemente der Keimstammzellnische. (4) Introgressions- und Allelersatzlinien zeigen, dass die Haupteffekte und Wechselwirkungen der beiden QTL auf den Chromosomen II und V (Lag-2-Deletion) teilweise antagonistisch sind und stark vom genetischen Hintergrund abhängen. (5) Daher prägen epistatische Wechselwirkungen höherer Ordnung die natürliche Variation der Nischenaktivität von Keimstammzellen.

Unsere Beobachtungen legen nahe, dass die Nischenaktivität der Keimstammzellen von C. elegans ein typisches komplexes Merkmal ist, das eine polygene Architektur beinhaltet. Zusätzliche Beobachtungen stützen diese Ansicht indirekt: (1) Die PZ-Größe variiert kontinuierlich und oft subtil in natürlichen Populationen (diese Studie); (2) die Lag-2-Deletion wurde in anderen Wildisolaten mit kleiner PZ-Größe nicht gefunden (diese Studie); und (3) Mutationen in einer großen Anzahl von Genen modulieren die PZ-Größe und diese Gene weisen vielfältige Funktionen auf, die nicht nur bei der Proliferation von Keimstammzellen, dem Fortschreiten des Zellzyklus und der Differenzierung wirken, sondern auch bei verschiedenen Stoffwechsel- oder Sinnesprozessen (Übersicht in 25,39). ). Zusammen mit unseren Erkenntnissen legen diese Beobachtungen nahe, dass die PZ-Größe von C. elegans ein Phänotyp höherer Ordnung ist, der wahrscheinlich Effekte der Allelvariation an vielen Orten integriert. In unserem Beispiel, das sich auf zwei Zielisolate mit ausgeprägten Unterschieden in der PZ-Größe konzentrierte, identifizierten wir auch Loci oder Varianten mit großem Effekt auf den Chromosomen II und V, deren Wirkungen teilweise antagonistisch waren und insgesamt stark vom genetischen Kontext abhingen. Zusammengenommen und im Einklang mit früheren Studien deutet dies darauf hin, dass die Auswirkungen von Varianten mit großen Effekten, selbst wenn sie auf molekularer Ebene gelöst werden (wie die Deletion von lag-2(cgb1007),) irreführend sein können, wenn epistatische Wechselwirkungen im nativen Hintergrund auftreten werden ignoriert4,79. Unsere Arbeit zeigt, dass die Generierung von Allelaustauschen im NIL-Hintergrund ein wirksames Mittel zur Aufdeckung dieser Wechselwirkungen ist, selbst wenn die spezifischen Varianten nicht bekannt sind.

Bei der Durchführung einer Kopplungs-QTL-Kartierung an einem Panel von F2-RILs, die von zwei Elternisolaten mit unterschiedlicher PZ-Größe abgeleitet waren, entdeckten wir vier teilweise interagierende QTL. Im besten Modell, das durch unseren Multi-QTL-Modellauswahlansatz identifiziert wurde, wirken QII und QV QTL additiv und erklären 32 % der phänotypischen Varianz in der untersuchten RIL-Population. Die Analyse von Introgressions- und Allelersatzlinien deckte jedoch umfangreiche epistatische Wechselwirkungen zwischen diesen Loci und dem genetischen Hintergrund auf. Dieser Befund ist nicht überraschend, da Gen-Gen-Wechselwirkungen zur Komponente der additiven genetischen Varianz (VA) beitragen, die auf Populationsebene gemessen wird; Das heißt, eine hohe VA-Varianz muss nicht die additive Genwirkung widerspiegeln7,80,81,82,83,84,85,86,87. Insbesondere hängen VA-Messungen aufgrund einzelner Loci stark von den Allelfrequenzen aller Loci ab, die zueinander epistatisch sind. Daher liefern Messungen der VA (und anderer genetischer Varianzkomponenten, einschließlich der epistatischen Varianz) wenig bis gar keine Informationen über die zugrunde liegenden epistatischen Interaktionen und damit über die Architektur genetischer Merkmale, selbst wenn QTLs erkannt wurden. Daher ist die Charakterisierung der molekularen Natur von QTLs und ihrer Interaktion in kontrollierten genetischen Hintergründen von wesentlicher Bedeutung.

Die Auflösung der QV-QTL-Region identifizierte eine einzigartige 148-bp-Deletion in der lag-2-Promotorregion von JU751, lag-2(cgb1007). Durch diese Löschung wird eine von sechs E-Box-Stellen entfernt, die für die Bindung von HLH-2 erforderlich sind, einem positiven Regulator der Lag-2-vermittelten Keimzellproliferation und Keimbahnexpansion30,73. Es wurde gezeigt, dass die Mutation dieser E-Box-Stellen zu einer verringerten lag-2::GFP-Transgenexpression insbesondere im L3-Stadium (und anschließend zu einer verringerten Keimzellproliferation) führt73. Wir gingen daher davon aus, dass lag-2 (cgb1007) aufgrund der verringerten HLH-2-Bindungsaktivität zu einer verringerten Lag-2-Expression führen würde. In Übereinstimmung mit diesem Szenario wurden durch die Einführung dieser Löschung in JU1200 (mit einer großen PZ-Größe) sowohl die PZ-Größe als auch die Lag-2-Expression im DTC erheblich reduziert (Abb. 5b, e). Im Gegensatz dazu führte die Wiederherstellung der entsprechenden Stammsequenz (JU1200) dieser Deletion in JU751 (mit einer kleinen PZ-Größe) zu einer weiteren Reduzierung der PZ-Größe zusammen mit der Lag-2-Expression, anstatt sie zu erhöhen (Abb. 5b, f). Das Lag-2-Deletions-Allel allein übt daher je nach genetischem Hintergrund gegensätzliche Wirkungen aus (Zeichenepistase). Die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen der Deletion lag-2(cgb1007) (C5) und einem zentralen Teil des QTL des Chromosoms II (C2) zeigt jedoch, dass C2-JU1200 diese Umkehrung dämpfen kann (Abb. 6c' vs. c"). In Darüber hinaus verändert die Lag-2-Deletion die Wirkung von C2, indem sie die negativen Auswirkungen von C2-JU751 in beiden Hintergründen dämpft (Abb. 6e' vs. e"). Dies weist darauf hin, dass C2 mit der lag-2-Promotorregion interagiert, insbesondere in der Region der lag-2(cgb1007)-Deletion. Wir haben keine Hypothesen bezüglich der molekularen Natur dieser Interaktion, da keines der Gene (hlh-2, lin-39, unc-130, daf-3/daf-5, ces-1) bestätigte Bindungsstellen oder Antwortelemente aufweist in der lag-2-Promotorregion liegen innerhalb der C2-Region. Obwohl in einigen dieser Gene (lin-39, unc-130 und daf-5) kodierende Polymorphismen (JU1200 gegenüber JU751) vorhanden sind, treten in hlh-2, daf-3 und ces-170 keine auf. Um diese genetische Interaktion zu analysieren, wäre daher die Auflösung des QII-QTL erforderlich. Insgesamt kann die Lag-2-Deletion, die eine HLH-2-Bindungsstelle enthält, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie die Lag-2-Expression in N2 positiv beeinflusst, je nach genetischem Kontext positive, negative oder neutrale Auswirkungen haben (Abb. 6).

Obwohl unklar bleibt, ob und wie die Deletion von lag-2 (cgb1007) zur verringerten PZ-Größe in JU751 beiträgt, liefern unsere smFISH-Messungen von lag-2-Transkripten im DTC eindeutige Belege dafür, dass Unterschiede in der transkriptionellen Aktivität von lag-2 zu Unterschieden im Keim beitragen Stammzell-Nischenaktivität zwischen JU751 und JU1200 beobachtet. Lag-2-smFISH-Messungen spiegelten die PZ-Größenmessungen nicht nur in Elternisolaten, sondern auch in reziproken ARLs, in denen das Lag-2-Promotorfragment manipuliert wurde, weitgehend wider (Abb. 5b). Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Variante zeigt, dass eine natürliche Variation der PZ-Größe durch direkte Modifikation von Kernsignalen auftreten kann, die in der Stammzellnische von C. elegans wirken. Allerdings können wir zusätzliche Beiträge von anderen nicht identifizierten Varianten im QV QTL nicht ausschließen. Auch wenn wir bei Stämmen, die lag-2(cgb1007) tragen, etwa die AC/VU-Zellschicksalspezifikation30,73, keine offensichtlichen Auswirkungen auf andere Larvenentwicklungsprozesse beobachteten, die Notch-Signalisierung (einschließlich der durch HLH-2 vermittelten Regulation) beinhalten, haben wir hat sie nicht konkret analysiert und kann sie daher nicht ausschließen.

Während die Aktivität jedes Keimstammzellsystems offensichtlich für die Fortpflanzungsfähigkeit eines Organismus relevant ist, ist nicht klar, ob und wie beobachtete natürliche Variationen in der Keimzellproliferation (und der PZ-Größe) zu Variationen in der Fortpflanzungsfähigkeit führen könnten. Obwohl festgestellt wurde, dass eine erhöhte Keimzellproliferation mit einer erhöhten Eiablageaktivität, Nachkommenproduktion und Eiqualität korreliert10,25,31,32,58,88,89, ist unklar, inwieweit dieser Zusammenhang kausal ist: C. elegans Die Fortpflanzung erfolgt hauptsächlich durch selbstbefruchtende Hermaphroditen, die für den Rest ihres Lebens nacheinander Spermien und dann Eizellen produzieren. Unter Laborbedingungen führt dies dazu, dass die Fruchtbarkeit von C. elegans durch die Menge der ursprünglich produzierten Selbstspermien (~250) begrenzt wird. Die PZ-Größe wird im Allgemeinen, wie in unserer Studie, im frühen Erwachsenenstadium gemessen, sodass sich viele der beobachteten Vorläuferzellen wahrscheinlich nie zu reifen Eizellen entwickeln und durch Selbstbefruchtung befruchtet werden. Eine erhöhte Keimzellproliferation ermöglicht jedoch eine verbesserte Eizellenqualität, indem der Fluss und die Anzahl der Eizellen, die einen physiologischen Zelltod (Apoptose) erleiden, hochreguliert werden, wodurch Ressourcen für die Versorgung mit überlebenden Eizellen freigesetzt werden10,25,31,32,58,88,89. Daher ist die PZ-Größe bei Erwachsenen möglicherweise kein direkter Indikator für das zukünftige Fortpflanzungspotenzial (Anzahl der Nachkommen), sie kann jedoch die Qualität der Nachkommen durch eine verbesserte Eizellenversorgung verbessern. Darüber hinaus spiegelt die PZ-Größe bei Erwachsenen auch die frühere proliferative Aktivität früherer Larvenstadien wider, wie unsere Quantifizierungen der proliferativen Aktivität veranschaulichen (Abb. 2b, 5d). Die Variation der PZ-Größe bei Erwachsenen könnte daher auf unterschiedliche Fortpflanzungsinvestitionen während der Larvenentwicklung zurückzuführen sein, die möglicherweise mit der Energieallokation für die somatische Entwicklung in Konflikt geraten.

Bezüglich der Unterschiede in der Fortpflanzungsfähigkeit der Zielisolate in unserer Studie, JU751 und JU1200, haben wir zuvor gezeigt, dass selbstsüchtige JU751-Hermaphroditen die Brutgröße im Vergleich zu JU120071 deutlich verringert haben. Diese Verringerung wird nicht durch eine unterschiedliche Spermienproduktion verursacht, sondern ist teilweise auf eine Variante mit Haupteffekt zurückzuführen, die bei JU75171 zu einem frühen Mutterschlüpfen führt. Selbst nach Korrektur dieser genetischen Variante in JU751 bleibt die Brutgröße in JU751 im Vergleich zu JU120071 deutlich kleiner. Es ist möglich, dass eine verringerte Keimzellproliferation (und eine geringere PZ bei Erwachsenen) bei JU751 eine geringere Investition in die Reproduktion widerspiegelt. Natürlich ist dieses Szenario höchst spekulativ und beobachtete Unterschiede müssen nicht adaptiv sein. Ebenso ignorieren wir, ob einer der erkannten QTL, einschließlich der Lag-2(cgb1007)-Löschung, durch Auswahl beibehalten wird. Auch wenn sie selektiv vorteilhaft sind, bleibt unklar, ob QTL aufgrund ihrer Auswirkungen auf die proliferative Aktivität der Keimbahn oder aufgrund möglicher pleiotroper Wirkungen auf zusätzliche Prozesse außerhalb der Keimbahn ausgewählt wurden, von denen bekannt ist, dass sie Notch-Signale während der Larvenentwicklung beinhalten30,73.

Hier konzentrierten wir uns auf die Analyse zweier QTLs mit großer Wirkung und ihrer Wechselwirkungen, die mithilfe einer relativ kleinen Gruppe von RILs (n = 70) nachgewiesen wurden. Daher war die Erkennung kleiner und zusätzlicher epistatischer Wechselwirkungen durch Verknüpfungskartierung aufgrund der relativ geringen statistischen Aussagekraft nicht möglich. Dennoch ergab eine gezielte Suche nach interagierenden Loci mit gegensätzlichen Effekten zwei QTL-Kandidaten auf den Chromosomen I und X (Abb. 3h). Eine weitere Analyse dieser antagonistischen Wechselwirkung wird wahrscheinlich durch ihre relativ geringe Effektgröße und die bereits komplexen Wechselwirkungen zwischen dem QTL des Chromosoms II, Lag-2 (cgb1007) und dem genetischen Hintergrund begrenzt sein. Darüber hinaus sind weitere Feinkartierungsexperimente erforderlich, um die hier aufgedeckten epistatischen Wechselwirkungen zwischen QII und QV QTL vollständig zu verstehen. Beide QTL könnten mehrere Loci beherbergen, die die Variation der PZ-Größe beeinflussen, möglicherweise auch eng verbundene, antagonistische Loci, die in C. elegans häufig vorzukommen scheinen79.

Über diese technischen Einschränkungen hinaus erschweren mehrere andere Probleme die Interpretation unserer Ergebnisse. In erster Linie können künstliche Kartierungspopulationen, wie das hier verwendete F2-RIL-Panel, durch die Störung verknüpfter Genomregionen neuartige epistatische Interaktionen erzeugen. Dies ist besonders relevant für C. elegans, eine überwiegend selbstsüchtige Art, bei der eine geringe effektive Rekombination zu einem starken Bindungsungleichgewicht führt74,90,91,92. Besonders hervorzuheben ist, dass Kreuzungen zwischen wilden Isolaten der selbstbestäubenden Caenorhabditis eine konsistente, starke Auszuchtdepression aufgedeckt haben, die auf weit verbreitete genetische Inkompatibilitäten zurückzuführen ist, die das Überleben und die Fortpflanzung beeinträchtigen91,93,94,95,96. Solche epistatischen Interaktionen neuartiger Allelkombinationen, die in künstlichen C. elegans-Populationen erzeugt werden, wirken sich daher besonders wahrscheinlich auf Merkmale aus, die eine polygene Architektur beinhalten4,17,79,97,98. Mit anderen Worten: Epistatische Interaktionen, die in künstlichen Kartierungstafeln beobachtet werden, müssen nicht unbedingt epistatische Interaktionen widerspiegeln, die in freier Wildbahn auftreten. Dennoch liefert ihre Studie Einblicke in die genetische Architektur, die der Merkmalsvariation zugrunde liegt.

Zusammen mit früheren Forschungsergebnissen untermauert unsere Studie die Ansicht, dass Verallgemeinerungen zur Merkmalsarchitektur, die auf der isolierten Untersuchung einzelner molekularer Varianten in einzelnen genetischen Hintergründen basieren, wahrscheinlich irreführend sind. Die Kombination quantitativer und entwicklungsgenetischer Ansätze ist daher für das Verständnis der komplexen quantitativen Merkmalsarchitektur angesichts epistatischer und oft idiosynkratischer Interaktionen von wesentlicher Bedeutung. Angesichts der Tatsache, dass derzeit (und wahrscheinlich auch für lange Zeit) selbst die ausgefeiltesten Experimente nur einen winzigen Bruchteil aller möglichen epistatischen Interaktionen abfragen können, bietet die Integration entwicklungsbezogener und quantitativer genetischer Ansätze die beste Option, um uns dem Verständnis der genetischen Grundlagen von einen Schritt näher zu bringen Phänotypen und ihre Variation.

Alle in dieser Studie verwendeten C. elegans-Stämme sind in den ergänzenden Daten 2 aufgeführt. Standardmethoden von C. elegans wurden verwendet, um alle Stämme auf 2,5 % Agar-NGM-Platten, die mit dem E. coli-Stamm OP5099,100,101 ausgesät waren, bei 20 °C zu halten. Alle Experimente wurden an Hermaphroditen durchgeführt. Alle Stämme oder biologischen Materialien sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Bilder von präparierten Gonaden, fixiert in 100 % eiskaltem Methanol und gefärbt mit DAPI (VECTASHIELD® Antifade-Montagemedium mit DAPI), wurden mit einem Olympus BX61-Mikroskop mit einer CoolSnap HQ2-Kamera aufgenommen. Z-Stapel mit 1-μm-Schritten wurden im DAPI-Kanal bei 40-facher Vergrößerung durchgeführt. Die Kerne wurden manuell mit ImageJ2 v2.9.0/1.53t102 gezählt. Zunächst wurde die PZ als der Bereich neben der distalen Spitzenzelle definiert, der an der Übergangszonengrenze endet, wo zwei oder mehr halbmondförmige Kerne pro Reihe von Keimzellen beobachtet werden können38. Der Bildstapel wurde an der Vorläuferzone bis zur Übergangszonengrenze beschnitten und die Kerne wurden gezählt.

Die Proliferation mitotischer Keimzellen wurde in L4-Larven mit dem Click-IT EdU-Kit von Thermofisher (Kat.: C10338) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert, sofern nicht anders angegeben. Kurz gesagt, die Würmer wurden durch Hypochloritbehandlung synchronisiert (1:1:2 Bleichmittel:1 M NaOH:dH2O für 6 Minuten, dann geschleudert und dreimal in M9-Puffer gewaschen) und die Eier konnten über Nacht in M9-Puffer bei 20 °C schlüpfen. Die Eier wurden in einer Dichte von ca. 400 Eiern/Teller ausplattiert und man ließ sie sich bis L4 entwickeln. Larven der mittleren L4-Phase oder junge Erwachsene (1–10 Eier in der Gebärmutter) wurden isoliert, gewaschen und genau 15 Minuten lang in 100 μl 20 mM EdU in M9-Puffer einweichen gelassen (ausreichende Zeit, um 50–75 % der PZ anzufärben). bei jungen Erwachsenen). Die Würmer wurden schnell in M9 gewaschen, um das EdU zu entfernen, und die Gonaden wurden durch Schneiden auf anhaftenden Glasobjektträgern (Fisherbrand™ Superfrost™ Plus-Mikroskopobjektträger) freigesetzt. Zur Betäubung der Würmer wurde eine kleine Menge Levamisol verwendet. Die präparierten Gonaden wurden sorgfältig auf den Objektträgern gewaschen, in 4 % PFA fixiert und erneut gewaschen. Die Waschvorgänge wurden durch Auftragen kleiner Lösungsmengen direkt auf das Gewebe auf den Objektträgern und anschließendes vorsichtiges Absaugen durchgeführt. Nach einem letzten Waschen in dH2O wurde das Gewebe auf einem Objektträgerwärmer (35 °C für 5 Minuten) getrocknet, um das Gewebe an den Objektträgern zu befestigen. Die Objektträger wurden über Nacht bei –20 °C in 100 % MeOH eingeweicht. Am folgenden Tag wurden die Gewebe in PBST rehydriert und die EdU-Färbung wurde mit dem Click-IT EdU-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Click-IT-Färbeprotokoll wurde einmal wiederholt und dann wurden die Objektträger mit VECTASHIELD® Antifade-Eindeckmedium mit DAPI eingedeckt. Die Bildgebung erfolgte durch ein 40-fach-Objektiv auf einem Olympus BX61-Mikroskop mit einer CoolSnap HQ2-Kamera. Z-Stapel wurden durch die distale Gonade entnommen (einer pro Wurm). EdU-positive und DAPI-gefärbte PZ-Kerne wurden manuell mit ImageJ2 v2.9.0/1.53t102 gezählt.

Die Quantifizierung der PZ-Keimzellzahl kann bei vielen Proben ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt bei der Bewertung der PZ-Größe sein. Um dieses Hindernis zu überwinden, haben wir eine einfache Methode zur Schätzung der PZ-Größe entwickelt und diese als Proxy für die PZ-Zellenzahl verwendet (Abb. 1b und c). Kurz gesagt, die Linien wurden durch Hypochloritbehandlung synchronisiert (1:1:2 Bleichmittel:1 M NaOH:dH2O für 6 Minuten, dann geschleudert und dreimal in M9 gewaschen). Die Eier konnten über Nacht in M9-Puffer bei 20 °C schlüpfen. Am folgenden Tag wurden die Eier mit einer Dichte von ~400 Würmern/Platte auf mit OP50 beimpften Standard-NGM-Medien ausplattiert. Den Larven wurde ermöglicht, sich bei 20 °C zu jungen Erwachsenen zu entwickeln. Junge Erwachsene wurden durch Waschen der Platten gesammelt, wenn die meisten Tiere 1–10 Eier in der Gebärmutter zeigten. Die Proben wurden in M9 gewaschen und mindestens 5 Minuten in eiskaltem Methanol fixiert. Um Proben für die Bildgebung vorzubereiten, wurden die Würmer in M9 rehydriert und mit Vectashield-Eindeckmedium, das DAPI enthielt (Vector Laboratories, Burlingame, CA), auf Objektträger aufgetragen. Die distalen Keimbahnregionen junger erwachsener Hermaphroditen (mit 1–10 Embryonen in der Gebärmutter) wurden durch ein 40-fach-Objektiv auf einem Olympus BX61-Mikroskop mit einer CoolSnap HQ2-Kamera abgebildet. Pro Wurm wurde ein Gonadenarm abgebildet, nämlich der Arm, der sich zufällig näher an der Objektivlinse befand. Für jeden Wurm wurde ein einzelnes Bild aufgenommen, wobei die Schnittebene die meisten Kerne auf einer Seite der Keimdrüse erfasste, so dass halbmondförmige Kerne sichtbar waren und die Form der Keimdrüse in dieser Ebene repräsentativ für die meisten Ebenen war (Abb . 1b). Anschließend wurde die PZ-Größe für jedes Bild quantifiziert. Die Vorläuferzone wurde als der Bereich neben der distalen Spitzenzelle definiert, der an der Übergangszonengrenze endet, wo zwei oder mehr halbmondförmige Kerne pro Reihe von Keimzellen beobachtet werden können38. Die PZ wurde mit ImageJ2 v2.9.0/1.53t102 von allen anderen Geweben abgeschnitten, und das Schwellenwert-Tool wurde verwendet, um die Anzahl der hervorgehobenen PZ-Kerne zu maximieren und gleichzeitig den hervorgehobenen Hintergrund zu minimieren. Die Anzahl der hervorgehobenen Pixel wurde als PZ-Bereich aufgezeichnet. Diese Schätzmethode korreliert gut mit der Handzählung von PZ-Kernen (Abb. 1c).

Wir haben die PZ-Größe in einem Satz von 70 SNP-genotypisierten RILs quantifiziert, die von den beiden Eltern JU1200 und JU75171,103 stammen. Die Linien wurden in sechs Wertungsblöcke unterteilt und über einen Zeitraum von acht Wochen gewertet. Während einige Belastungen in zwei getrennten Blöcken gemessen wurden, war dies nicht bei allen der Fall. Die meisten Stämme wurden nur einmal gemessen, mit 30–40 Individuen pro Stamm. Die Durchschnittswerte und Varianzen für Stämme, die zweimal gemessen wurden, waren zwischen den Messungen ähnlich. Für die QTL-Kartierung wurde nur ein Messsatz verwendet. Die PZ-Größe wurde unter Verwendung eines Korrekturfaktors blockübergreifend normalisiert. Der Korrekturfaktor wurde aus dem kleinsten Quadratmittelwert jedes Blocks (lsmeans-Paket v. 2.30-0) für jede Beobachtung abgeleitet (Korrekturfaktor = LSMBlockX/LSMBlock1). Die normalisierte PZ-Größe wurde mit dem Softwarepaket R/qtl (v. 1.50)72 abgebildet. Zunächst wurde eine genetische Verknüpfungskarte aus den SNP-Genotypen aller 70 RILs abgeleitet. Anschließend wurde eine Einzel-QTL- und Zwei-QTL-Standardintervallzuordnung basierend auf Hidden-Markov-Modellen verwendet, um Kandidaten-QTL zu identifizieren. Die LOD-Schwellenwerte wurden auf das 95. Perzentil der maximalen genomweiten LOD-Werte festgelegt, die aus 5.000 zufälligen Permutationen der Daten unter der globalen Nullhypothese von null QTL abgeleitet wurden. Diese QTL-Kandidaten dienten als Ausgangspunkt für die Multi-QTL-Modellierung, bei der die R/qtl-Software für jedes getestete Modell bestrafte LOD-Werte generiert. Modelle, die besser abschneiden als die Nullhypothese von Null-QTL, haben eine bestrafte LOD > 0. Wir haben das Modell mit dem höchsten bestraften LOD-Score ausgewählt, wie von den Autoren von R/qtl empfohlen (Abb. 3j)72.

Um das genomische Intervall des QTL auf Chromosom II zu validieren, haben wir nahezu isogene Linien (NILs) konstruiert. Zwei RILs mit JU1200-Sequenz in der QTL-Region (RIL128/NIC728 und RIL71/NIC671) und zwei RILs mit JU751-Sequenz in der QTL-Region (RIL127/NIC727 und RIL54/NIC654) wurden 10–12 Generationen lang rückgekreuzt, um die Region in der Region zu isolieren Hintergrund des anderen Elternteils. Die Linien wurden bei jeder Generation basierend auf der PCR-Genotypisierung mehrerer INDELS im Chromosom II-QTL ausgewählt (siehe Ergänzungsdaten 1 für Primer und Ergänzungsdaten 2 für erstellte Linien und ihre Genotypen).

Um den INDEL-Kandidaten vor Lag-2 im QTL des Chromosoms V zu validieren, erstellten wir reziproke Allelersatzlinien (ARLs) mithilfe der CRISPR/Cas-9-Bearbeitung unter Verwendung eines Protokolls, das dem von104 beschriebenen ähnelt. Um die Deletion (cgb1007) in den JU1200-Hintergrund einzuführen, wählten wir eine NIL-haltige JU751-Sequenz durch den größten Teil des Chromosom-II-QTL (NIC1701) und injizierten sgRNAs (Synthego Corp.), um einen doppelten Schnitt um die Insertionsstelle im Lag- zu induzieren. 2 Promotor (Ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Daten 1). Wir haben ein einzelsträngiges Donor-Oligonukleotid mitinjiziert, das als Reparaturvorlage fungiert (Ergänzungsdaten 1). dpy-10 wurde in einer Co-CRISPR-Strategie104 verwendet. Linien aus separaten Injektionen, die erfolgreiche Ersetzungen in Lag-2p enthielten, wurden durch PCR-Genotypisierung der Deletion und Sanger-Sequenzierung identifiziert. Diese Linien wurden dann mit JU1200 gekreuzt, um die Chromosom II enthaltende JU751-Sequenz abzutrennen und Linien zu erzeugen, die sowohl die JU751-Version des Chromosom II QTL und die lag-2p(cgb1007)-Deletion (NIC1713, NIC1714, NIC1715) als auch eine Linie enthielten Enthält nur die Lag-2p-Löschung (cgb1007) im JU1200-Hintergrund (NIC1720). Um die angestammte Lag-2p-Deletionssequenz (cgb1008) im JU751-Hintergrund zu ersetzen, wählten wir eine NIL-haltige JU1200-Sequenz im Chromosom II-QTL (NIC1672) aus und injizierten Guide-RNAs (Synthego Corp.) (Supplementary Data 1), um ein Double zu induzieren Schneiden Sie um die Einstichstelle herum. Wir injizierten ein doppelsträngiges PCR-Produkt, das die angestammte Sequenz (JU1200) enthielt, mit lag-2p (cgb1008), um als Reparaturvorlage zu dienen (Ergänzungsdaten 1). dpy-10 wurde in einer Co-CRISPR-Strategie gemäß104 verwendet. Linien aus separaten Injektionen, die erfolgreiche Ersetzungen enthielten, wurden durch PCR-Genotypisierung von lag-2p (cgb1008) und Sanger-Sequenzierung identifiziert. Diese Linien wurden dann mit JU751 gekreuzt, um die Chromosom II enthaltende JU1200-Sequenz abzutrennen, so dass wir Linien erhielten, die sowohl die JU1200-Version des Chromosom II QTL und lag-2p(cgb1008) (NIC1716, NIC1717, NIC1719) als auch Linien enthielten nur Lag-2p (cgb1007) im JU751-Hintergrund (NIC1723, NIC1724, NIC1725). Eine Tabelle aller erstellten Linien und Genotypen finden Sie unter Ergänzende Daten 2.

Die Würmer wurden wie oben bleichsynchronisiert und bis zum entsprechenden Entwicklungsstadium bei 20 °C gezüchtet. Anschließend wurden die Würmer von den Platten abgewaschen und 40 Minuten lang in 1 ml frischem Fixiermittel (4 % Formaldehyd in PBS) fixiert. Die Würmer wurden zweimal in PBS gewaschen, in 1 ml 70 %igem Ethanol resuspendiert und mehrere Tage bei 4 °C gelagert. Ein an AF594 (Custom Stellaris Fish Probes, Biosearch Tech, Teddington UK) gekoppelter Lag-2-RNA-Sondensatz (Barkoulas et al. 2013) wurde in RNase-freiem TE-Puffer (pH 8) resuspendiert, um eine 100 μM-Stammlösung herzustellen, und dann 1 verdünnt :30 (Arbeitslösung) in RNase-freiem Wasser. Fixierte Würmer wurden 3 Minuten in 1 ml Waschlösung (10 % entionisiertes Formamid und 2x Natriumcitrat-Salzpuffer (Ambion) in RNase-freiem Wasser) gewaschen. Anschließend wurden die Würmer in 100 μl Hybridisierungslösung (10 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 2x SSC) + 1 μl der Lag-2-Sonden-Arbeitslösung resuspendiert und über Nacht bei 30 °C im Dunkeln inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Proben gespült, 30 Minuten bei 30 °C in Waschlösung gewaschen und 30 Minuten bei 30 °C in 1 ml Waschlösung + DAPI (7,5 μg/ml endgültig, Sigma) gefärbt. Abschließend wurden die Proben zweimal in PBS gewaschen und in Prolong Diamond Antifade-Eindeckmedium (Eugene, OR) auf Objektträger aufgezogen. Würmer wurden unter Epifluoreszenz auf einem inversen Zeiss Z.1-Mikroskop mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv abgebildet. Für alle Proben wurden die gleichen Beleuchtungs- und Belichtungseinstellungen (Software Zen 3.2 Blue Edition) verwendet. Z-Stapel wurden mit einer Schrittgröße von 0,4 μm durch den DTC geführt und fluoreszierende Punkte wurden manuell mit der ImageJ2-Software (NIH, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/) quantifiziert102.

Statistische Analysen wurden mit R Statistical Software (R Version 4.2.0, RStudio 2022.02.3 Build 492) unter Verwendung verallgemeinerter linearer gemischter Modelle105 durchgeführt. Die Daten wurden mit dem glmmTMB-Paket v. 1.1.3106 entweder an Gaußsche oder negative Binomialmodelle (nbinom2) angepasst. Die Restdiagnose wurde mit dem DHARMa-Paket v. 0.4.5 gemäß den Richtlinien des Entwicklers107 durchgeführt. Wenn die Modellauswahl gerechtfertigt war, wurde das Bayes'sche Informationskriterium (BIC) zur Auswahl des optimalen Modells verwendet. Das emmeans-Paket v. 1.7.4-1 wurde verwendet, um modellgeschätzte Randmittel, Standardfehler und Tukey-korrigierte p-Werte für paarweise Kontraste zu berechnen108. Zur Modellanpassung des Interaktionsdatensatzes entsprechend Abb. 6 wurde D2 mit dem modEvA-Paket v. 3.078 berechnet. Spezifische Details zu jeder Datenanalyse werden in den Ergänzenden Anmerkungslegenden beschrieben, in denen die statistischen Ergebnisse angezeigt werden (Ergänzende Anmerkungen 1 bis 12). Andere R-Pakete, die für die Datenbearbeitung und -darstellung verwendet wurden, waren Tidyverse v. 1.3.1109, MASS v. 7.3-57110, ggbeeswarm v. 0.6.0111, rnaturalearth und rnaturalearthdata v. 0.1.0112, rgeos v. 0.5-9113 und sf v . 1.0-7114.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Rohdaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Die folgenden öffentlich zugänglichen Datenbanken wurden in dieser Studie referenziert und verwendet: Wormbase WS283 (https://wormbase.org/#012-34-5) und die C. elegans Natural Diversity Resource (https://elegansvariation.org/). In diesem Artikel werden keine Originalalgorithmen beschrieben. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Es wurde nur begrenzter Code generiert, um die R-Pakete für statistische Analysen zu verwenden und benutzerdefinierte Diagramme gemäß den Richtlinien der Entwickler zu erstellen (siehe Ergänzende Hinweise 1–12 und die Methoden).

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Wir danken Nausicaa Poullet, Anne Vielle und Clotilde Gimond für ihre Beiträge zur experimentellen Arbeit, die dieses Projekt initiiert hat. Wir danken Fabien Duveau, Marie-Anne Félix, Luke Noble, Alistair McGregor, Clotilde Gimond, Laure Mignerot und Joao Picao Osorio für die Diskussion, hilfreiche Kommentare zu früheren Versionen des Manuskripts und technischen Rat. C. elegans-Stämme wurden freundlicherweise von der Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) und Marie-Anne Félix zur Verfügung gestellt. Wir möchten uns auch bei CeNDR (https://elegansvariation.org/) und WormBase (https://wormbase.org/) für die Bereitstellung von Ressourcen bedanken, ohne die die hier durchgeführten Analysen nicht möglich gewesen wären. Diese Studie wurde durch Projektzuschüsse der Fondation ARC sur la recherche sur le cancer (PJA 20161205047 an CB) und der Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE02-0017 an CB) unterstützt. SRF wurde durch ein Postdoktorandenstipendium unterstützt aus der Stadt Nizza, Frankreich (Ville de Nice: Aides Individuelles Jeunes Chercheurs). Wir danken dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), dem Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) und der Université Côte d'Azur (UCA) für zusätzliche institutionelle Unterstützung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Asma Sandjak, Bénédicte Billard.

Universität Côte d'Azur, CNRS, Inserm, IBV, Nizza, Frankreich

Sarah R. Fausett, Asma Sandjak, Bénédicte Billard und Christian Braendle

Abteilung für Biologie und Meeresbiologie, University of North Carolina Wilmington, Wilmington, NC, USA

Sarah R. Faucett

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Konzeptualisierung, SRF und CB; Methodik, SRF, AS, CB; Untersuchung, SRF, BB und AS; Formale Analyse und Visualisierung, SRF; Schreiben – Originalentwurf, SRF; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, SRF, CB; Aufsicht und Projektverwaltung, CB; Finanzierungsakquise, CB, SRF

Korrespondenz mit Sarah R. Fausett oder Christian Braendle.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Eric Haag, Ekaterina Voronina und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fausett, SR, Sandjak, A., Billard, B. et al. Epistase höherer Ordnung prägt die natürliche Variation der Nischenaktivität von Keimstammzellen. Nat Commun 14, 2824 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38527-0

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Eingegangen: 12. Dezember 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 17. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38527-0

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