Messung der Hämolyse in Rinderserum durch direktes UV

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13523 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Für den routinemäßigen Nachweis und die Quantifizierung der Hämolyse, einer der Hauptursachen für unzuverlässige Ergebnisse bei der Serumanalyse, ist ein einfaches, schnelles Verfahren erforderlich. In dieser Studie haben wir zwei unterschiedliche Ansätze zur schnellen Bestimmung der Hämolyse in Rinderserum verglichen. Die erste bestand darin, die Hämolyse durch eine einfache direkte ultraviolett-sichtbare (UV-VIS) spektrophotometrische Messung von Serumproben abzuschätzen. Die zweite umfasste die Analyse von Rot-, Grün- und Blau-Farbdaten (RGB), die aus digitalen Bildern von Serumproben extrahiert wurden, und die Beziehung des Hämoglobingehalts (Hb) mittels univariater (R, G, B und Intensität separat) und multivariater Kalibrierungen (R , G, B und Intensität gemeinsam) unter Verwendung der partiellen Regression der kleinsten Quadrate und künstlicher neuronaler Netze. Die direkte UV-VIS-Analyse und die RGB-multivariate Analyse unter Verwendung neuronaler Netzwerkmethoden waren beide für die Bewertung der Hämolyse in Serumproben von Rindern geeignet. Die Verfahren zeigten eine gute Genauigkeit (mittlere Wiederfindung von 100,7 bzw. 102,1 %), ausreichende Präzision (mit Variationskoeffizienten von 0,21 bis 2,68 %), Nachweisgrenze (0,14 bzw. 0,21 g L–1) und Linearität von up bis 10 g L–1.

Unter Hämolyse versteht man die Zerstörung der Erythrozytenmembranen mit anschließender Freisetzung des Zellinhalts in die umgebende Flüssigkeit. Dies kann auf eine unzureichende Probenhandhabung oder eine Pathologie zurückzuführen sein. Hämolyse tritt in vitro häufig aufgrund falscher Probenentnahme, -transport, -vorbereitung oder -lagerung auf. In-vivo-Hämolyse ist seltener und tritt aufgrund pathologischer Zustände wie Infektionen, toxischer Wirkungen, immunvermittelter Krankheiten, erblicher Erkrankungen der roten Blutkörperchen, disseminierter intravaskulärer Gerinnung sowie mechanischer und anderer Faktoren vor der Blutentnahme auf1. Eine In-vivo-Hämolyse kann schwerwiegende Folgen für Patienten haben. Daher werden Tests mit dem Ziel durchgeführt, zwischen In-vivo- und In-vitro-Hämolyse zu unterscheiden, da jeder Verdacht auf einen pathologischen Ursprung weiter untersucht werden muss.

Unabhängig vom Ursprung ist die Hämolyse die häufigste Ursache für Probenabstoßungen in der klinischen Pathologie des Menschen2 und dürfte auch ein häufiger Fehler in der Veterinärmedizin sein3. Die Hämolyse kann die Analyseergebnisse durch die Freisetzung intrazellulärer Komponenten in das Plasma, die Verdünnung der Probe oder die Entstehung spektrophotometrischer oder chemischer Interferenzen verändern4. Die Ergebnisse einer routinemäßigen Blutanalyse können je nach Grad der Hämolyse, der beteiligten Tierart sowie der bei der Analyse verwendeten Methode und dem verwendeten Instrument variieren. Fehlberechnungen aufgrund von Hämolyse wurden für verschiedene Analyten wie Alaninaminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST), g-Glutamyltransferase (GGT), Kreatinkinase (CK), Laktatdehydrogenase (LDH), Lipase, Gesamtbilirubin, Albumin, berichtet. Glukose, Kreatinin, Harnstoff, Kalzium, Kupfer, Eisen, Magnesium, Molybdän, Selen, Zink, Kalium, Natrium und Chlorid5,6,7,8,9,10,11. Das Ausmaß des Unterschieds ist sehr unterschiedlich, da bei einigen Analyten der Zusammenhang mit dem Grad der Hämolyse linear ist, wie etwa bei Eisen, Zink, Kalium und Bilirubin, während z. B. bei Calcium und Chlorid ein nichtlinearer Zusammenhang besteht, der zu signifikanten Messwerten führen könnte Fehler1,7. Darüber hinaus kann die Hämolyse auch Immunoassays und Gerinnungstests beeinträchtigen12,13. Eine präanalytische Kontrolle der Hämolyse ist daher eine gute Praxis.

Die visuelle Erkennung ist die einfachste Möglichkeit, die Hämolyse in einer Probe zu bestimmen, da die Farbe je nach Hämolysegrad variiert. Mehrere Studien14,15 haben jedoch gezeigt, dass die visuelle Untersuchung ein unzuverlässiges Mittel zur Beurteilung der Hämolyse ist und dass diese Praxis klinische Entscheidungen beeinflussen könnte16. Obwohl eine Konzentration an freiem Hämoglobin (Hb) ≥ 0,5 g L–1 als klinisch signifikant für die hämolyseempfindlichsten Tests angesehen wird17, sind einige Forscher der Ansicht, dass eine zuverlässige visuelle Erkennung von Konzentrationen unter 2 g L–1 aus diesem Grund schwierig sein kann18 individuelle Variationen in der Farbe des Serums. Daher könnte die visuelle Inspektion von Proben zu verzerrten Ergebnissen führen und einige Analyten wie LDH und AST würden beeinträchtigt, selbst wenn eine Hb-Konzentration im Serum von weniger als 0,5 g L–1 nachgewiesen wird8. Aus diesen Gründen ist die Quantifizierung der Hämolyse wichtig, um unnötige Probenausschleusungen zu verhindern. Daher müssen objektive Messungen durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob Proben auf der Grundlage der erforderlichen Akzeptanzschwelle für jede Art von Analyse abgelehnt oder akzeptiert werden sollten. Darüber hinaus könnte die Auswertung der Hämolyse auch nützlich sein, um die Richtung einer etwaigen Verzerrung der Parameter anzuzeigen, auch wenn von der Verwendung von Korrekturformeln generell abgeraten wird2.

Die Notwendigkeit, den Grad der Hämolyse abzuschätzen, hat Hersteller automatisierter Geräte (insbesondere in der klinischen Biochemie) dazu veranlasst, Techniken zu entwickeln, die auf dem Hämolyseindex (HI) basieren. Der HI ist ein Maß für die rote Farbe des Serums, die fast ausschließlich durch Hb verursacht wird, das aus geplatzten roten Blutkörperchen stammt. Allerdings wird der HI in den verschiedenen verfügbaren Geräten auf unterschiedliche Weise geschätzt, und es mangelt an einer Harmonisierung der Methoden, die von verschiedenen Herstellern zur Erkennung und Quantifizierung der Hämolyse verwendet werden19. Darüber hinaus verfügen kleinere, weniger gut ausgestattete Labore und Labore, in denen Blutproben nur gelegentlich analysiert werden, möglicherweise nicht über automatisierte Geräte zur Messung von HI. Das Hauptziel der vorliegenden Studie bestand daher darin, eine einfache Methode zur Quantifizierung des Hämolysegrades in Serumproben in Laboren zu entwickeln, in denen keine automatisierten Geräte verfügbar sind. An Rinderserumproben wurden zwei unterschiedliche Methoden getestet. Die erste Methode basiert auf der direkten Messung der Serumfarbe mittels Ultraviolett-Vis-Spektrophotometrie (UV-VIS), da die meisten Labore normalerweise über die spektrophotometrische Ausrüstung verfügen. Die zweiten Methoden zur Schätzung der Hämolyse basieren auf RGB-Daten aus digitalen Bildern von Serumproben. Die RGB-Informationen werden mit einer kostenlosen Bildverarbeitungssoftware aus digitalen Bildern der Proben extrahiert und aus diesen Daten die Vorhersage des Hämolysegrades mittels partieller Regression der kleinsten Quadrate oder eines künstlichen neuronalen Netzwerks getroffen. Dieses System zur Messung der Hämolyse könnte möglicherweise von kleinen Feldlaboren verwendet werden, in denen keine spektrophotometrische Ausrüstung verfügbar ist, oder von Ärzten, die die Eignung und Qualität von Serumproben bestimmen müssen, bevor sie sie an ein Speziallabor senden, da die falsche Kategorisierung der Proben im Vordergrund steht Ursache der Hämolyse in der präanalytischen Phase1.

Die Datenerfassung erfolgte gemäß der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere20 und der Versuch entsprach den spanischen Rechtsvorschriften zur Tierpflege21. Die Verfahren wurden von der Bioethikkommission des Veterinärmedizinischen Lehrkrankenhauses Rof-Codina der Universität Santiago de Compostela (Spanien) genehmigt (AELU001/21/INVMED(02)/Animal(05)/MM/01). Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet.

Blut wurde aus der Halsvene von zehn gesunden Holstein-Friesian-Kühen entnommen, die für die Schulung klinischer Untersuchungsmethoden verwendet wurden und im Veterinärmedizinischen Lehrkrankenhaus Rof-Codina der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Santiago de Compostela (Spanien) untergebracht waren.

Von jeder Kuh wurden drei Arten von Blutproben entnommen, um Serum zu gewinnen, das Hämolysat vorzubereiten und für die hämatologische Analyse. In 9-ml-Serumröhrchen (Vacuette®, CAT Serum Clot Activator; Greiner bio-one, Kremsmünster, Österreich) gesammelte Vollblutproben wurden innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme 15 Minuten lang bei 1500 g zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Die Serumröhrchen wurden zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert. Das Hämolysat wurde durch Einfrieren (–20 °C) von Vollblutproben gewonnen, die in 9-ml-Röhrchen mit Natriumheparin (Vacuette®, NH Natriumheparin, Greiner bio-one, Kremsmünster, Österreich) gesammelt wurden. Die hämatologische Analyse wurde an Vollblutproben durchgeführt, die in 6-ml-Röhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) entnommen wurden (Vacuette®, K2E EDTA K2, Greiner bio-one, Kremsmünster, Österreich).

Jede Serumprobe wurde in sieben Unterproben aufgeteilt, denen zunehmende Mengen an Hämolysat zugesetzt wurden, um eine Hämolyse von 0,0 %, 0,2 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,5 %, 5,0 % und 10 % zu erzeugen (Abb. 1). Der Grad der Hämolyse, ausgedrückt in Gramm Hb pro Liter, wurde aus der Hb-Konzentration jeder Vollblutprobe berechnet, die in einem automatischen Blutzellenzähler bestimmt wurde. Der Zusammenhang zwischen der Hb-Konzentration in den Proben einschließlich der einzelnen überlagerten Punkte und dem Hämolysegrad im Bereich von 0,0–10 % wird in einem Box-and-Whisker-Plot dargestellt (Abb. 2). Aufgrund der natürlichen Variabilität des Hb-Gehalts und des freien Blut-Hb in Erythrozyten verschiedener Personen variiert die Hb-Konzentration geringfügig mit dem Grad der Hämolyse. Daher wurden in den verschiedenen vorgeschlagenen Methoden insgesamt 70 abgestufte Hämolyseproben verwendet.

Farbe von Serumproben mit unterschiedlichen Hämoglobin (Hb)-Konzentrationen (von links nach rechts: 0,0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 bzw. 10 g L–1). (Aufgenommen in unserem Labor an der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Santiago de Compostela am 24. Mai 2022 von C. Herrero Latorre mit einem Apple Iphone 12).

Box- und Whisker-Plot der Serumhämoglobinkonzentration (Hb) im Verhältnis zum Hämolysegrad der Proben.

Zur Erstellung eines vollständigen Blutbildes wurde ein automatisierter Blutzellenzähler (ProCyte Dx, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, USA) verwendet, der auf einer Kombination aus Fluoreszenz-Laser-Durchflusszytometrie und Laminar-Flow-Impedanz-Technologien basiert. Die hämatologischen Parameter waren bei allen Kühen normal22. Spektrophotometrische UV-VIS-Messungen wurden in einem Thermo Scientific Genesys 6-Spektrophotometer (Thermo Electron Corporation, Madison, USA) durchgeführt. Blutproben wurden in einer iFuge-D06-Zentrifuge (Neuation Technologies, Gujarat, Indien) zentrifugiert.

Digitale Bilder wurden in einem internen System erhalten, das in einem früheren Artikel23 ausführlich beschrieben wurde. Kurz gesagt besteht das System aus einer digitalen Spiegelreflexkamera (Canon-50D), die mit kontrolliertem Licht einer weißen LED betrieben wird. Die Kamera war mit einem Sigma 105 mm f/2.8 Makroobjektiv ausgestattet und konnte mit der vom Hersteller mitgelieferten Steuerungssoftware (EOS Utility 2.14.10) von einem Notebook aus ferngesteuert werden. Digitale Bilder wurden verarbeitet, um RGB-Daten mit der Software ImageJ 1.52a zu erhalten, die von den National Health Institutes, USA, entwickelt wurde (kostenlos verfügbar unter http://imagej.nih.gov/ij). Univariate und multivariate Kalibrierungsverfahren mit partieller kleinster Quadratregression und andere statistische Berechnungen wurden mit Statgraphics Centurion XVIII, Version 18.1.12 (Statistical Graphics, Rockville, Madison, USA) durchgeführt. Neuronale Netze wurden mit WinNN32, Version 1.6a (Y. Danon. Arad, Israel) entwickelt. Andere statistische Berechnungen (wie der gemeinsame Test für Steigung und Achsenabschnitt) wurden unter Verwendung der Bibliothek Ellipse in der freien Softwareumgebung für statistische Berechnungen und Grafiken R, Version 4.0.5 (R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich) durchgeführt.

Hämoglobin ist das wichtigste intrazelluläre Molekül in roten Blutkörperchen und daher der beste Indikator für den Grad der Hämolyse in Blutproben. Die Hb-Konzentration in den abgestuften Hämolyseproben wurde mit der Cyanmethämoglobin-Methode (der internationalen Referenzmethode zur Messung der Hb-Konzentration) mit einem Labortestkit (Spinreact, Girona, Spanien) gemessen. Grundsätzlich wird Hb durch Kaliumferricyanid zu Methämoglobin oxidiert, das durch Kaliumcyanid in Cyanmethämoglobin (CNMHb) umgewandelt wird. Die Intensität der gebildeten Farbe (gemessen bei 540 nm mittels UV-VIS-Spektrophotometrie) ist direkt proportional zur Hb-Konzentration in der Probe. Die mit den in den beiden folgenden Abschnitten beschriebenen vorgeschlagenen Methoden erzielten Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die mit diesem CNMHb-basierten Verfahren erzielt wurden.

Hämoglobin kann durch direkte spektroskopische Messung von Serumproben bei 540 nm geschätzt werden, was einer der Hauptabsorptionspeaks dieser Verbindung und ihrer Derivate ist. In der vorliegenden Studie wurde diese direkte Messmethode auf Verdünnungen (1:10) der abgestuften Hämolyseproben angewendet.

Diese Methode basiert auf den Farbinformationen, die einzelne digitale Bilder der Proben liefern. Hämolysierte Serumproben wurden in Spektrophotometerküvetten (1,75 ml) gegeben, die in einem festen Abstand (15 cm) von der Brennebene der Kamera gehalten wurden. In allen Fällen wurden Bilder mit manuellem Fokus aufgenommen, der auf den zentralen Punkt der Küvette zielte, mit den folgenden Einstellungen: fester benutzerdefinierter Weißabgleich (5200 K), Blende f2,8, Belichtungszeit 1/10 s und fotografische Empfindlichkeit von 100 ASA. Die Bilder wurden per ferngesteuerter, computergestützter Bedienung aufgenommen, um unerwünschte Bewegungen der Kamera zu verhindern, und alle Bilder wurden direkt als unkomprimierte JPEG-Dateien auf der Festplatte des Computers gespeichert. Frühere Experimente haben gezeigt, dass das JPEG-Format anderen Formaten wie Roh- oder TIFF-Dateien vorzuziehen ist23. Die aus JPEG-Dateien extrahierten RGB-Histogramme behielten die Farbinformationen in kleineren Dateien als Roh- oder TIFF-Dateien bei, was eine schnellere Verarbeitung ermöglichte und viel weniger Speicherplatz beanspruchte. Die R-, G-, B- und gewichteten Intensitätswerte wurden mit ImageJ, einem Open-Source-Bildverarbeitungsprogramm für mehrdimensionale Bilder, aus den Fotos extrahiert. Für jede Probe wurden die RGB-Werte, die die Intensität der Farben Rot, Grün und Blau angeben, mit der ImageJ-Software aus jedem Bild extrahiert. Jeder Intensitätswert wird auf einer Skala von 0 bis 255 (256 Kanäle) ausgedrückt, wobei höhere Kanalnummern hellere Farben bedeuten. Der Farbwert, der als analytisches Signal gilt, hängt von der Hb-Konzentration ab. Im vorliegenden Fall wurden zwei verschiedene Kalibrierungsverfahren getestet: i) univariate Kalibrierung mit jedem der R-, G-, B- und Intensitätswerte; und ii) multivariate Kalibrierung basierend auf allen vier R-, G-, B- und Intensitätsvariablen gemeinsam mittels partieller Regression der kleinsten Quadrate (PLSR) und mehrschichtigem künstlichen neuronalen Feed-Forward-Netzwerk (MLF-ANN).

Aus den Beispieldaten wurde eine Datenmatrix (X70x7) erstellt. In allen Fällen entsprachen die Zeilen (70) hämolysierten Serumproben und die Spalten (7) den numerischen Werten der sieben Variablen, die die Proben charakterisierten: (1) der Probencode; (2) der mit der CNMHb-Methode bestimmte Hb-Wert; (3) die Absorption der Proben, gemessen bei 540 nm durch UV-VIS-Spektrophotometrie; und (4–7) jeweils die Werte von R, G, B und die gewichtete Intensität, die aus den digitalen Bildern mit der ImageJ-Software erhalten wurden.

Die Datenmatrix wurde verschiedenen univariaten und multivariaten chemometrischen Kalibrierungen unterzogen, um die Beziehung zwischen der Hb-Konzentration und den berücksichtigten analytischen Signalen zu untersuchen. Bei der direkten UV-VIS-spektrophotometrischen Methode wurde eine univariate Kalibrierung für die Absorption bei 540 nm durchgeführt und der Hb-Wert durch CNMHb bestimmt. Bei den RGB-Verfahren wurde sowohl die univariate als auch die multivariate Kalibrierung untersucht. Beim univariaten Ansatz wurden die R-, G-, B- und gewichteten Intensitätswerte gegen den Wert von CNMHb-Hb aufgetragen. Für multivariate Kalibrierungen wurde ein Satz von vier Prädiktor-X-Variablen (R, G, B und gewichtete Intensität) und eine abhängige Y-Antwort (Hb-Gehalt) berücksichtigt. Zwei verschiedene Ansätze (PLSR und MLF-ANN) wurden verwendet, um verschiedene mathematische Modelle für die Vorhersage zu erstellen. Die PLSR-Methode beinhaltet die Ableitung der komplexen Beziehung zwischen X-Variablen und der Y-Antwort. Zur Vorhersage (bestimmt durch Kreuzvalidierung) wurde eine begrenzte Anzahl latenter Faktoren (LF) mittels PLSR konstruiert. Die LFs sind mit Richtungen im Faktorraum verbunden, die mit einer hohen Variation in der Y-Antwort zusammenhängen, und sie sind voreingenommen, um die beste Vorhersage zu erhalten (für eine detailliertere Erklärung siehe Geladi und Kowalski24). Andererseits ist MLF-ANN eine leistungsstarke Mustererkennungstechnik, die Modelle auf der Grundlage einer Reihe von Eingabe-/Ausgabeproben (RGB-Farbdaten und Hb-Inhalt) entwickelt und dabei die Gewichtungen zwischen Neuronenverbindungen aktualisiert und ändert, um eine angemessene Ausgabe zu erzielen jeder Eingang. Somit liefern die Gewichte der Verbindungen nützliche Informationen über die Beziehung zwischen eingegebenen Farbdaten und dem ausgegebenen Hb-Gehalt. Allerdings sind diese Informationen chemisch nicht interpretierbar25.

Die Validierungsstrategien waren für univariate und multivariate Ansätze unterschiedlich. Für univariate Methoden wurde der Satz von 70 Proben in Teilmengen zur Kalibrierung (49 Proben: 70 % der Gesamtzahl) und zur Validierung (21 Proben, 30 %) unterteilt. Die Zuordnung der Proben zu den einzelnen Untergruppen erfolgte nach dem Zufallsprinzip, jedoch unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Hb-Konzentrationen. Diese Probenanordnung lieferte genügend Informationen für die Erstellung univariater Modelle und eine entsprechende Validierung mit den verbleibenden Proben. Für multivariate Kalibrierungen (PLSR und MLF-ANN) sollten die Modelle unter Verwendung möglichst vieler Informationen erstellt werden, und es stimmt, dass die optimale Situation eine große Anzahl von Proben wäre, die es ermöglichen würde, über genügend Proben zu verfügen, um zwei unabhängige und zu erstellen große Sets zum Lernen und Validieren. Im vorliegenden Fall ist aufgrund der begrenzten Anzahl verfügbarer Stichproben ein verschachteltes Kreuzvalidierungsverfahren erforderlich, das unabhängig von der reduzierten Stichprobengröße robuste und unvoreingenommene Leistungsschätzungen liefert26. 90 % der Proben wurden zur Erstellung des Vorhersagemodells verwendet und die anderen 10 % werden zur Validierung verwendet. Gemäß dieser Satzverteilung wurde ein zehnfach verschachteltes Kreuzvalidierungsverfahren mit unterschiedlichen Zusammensetzungen von Trainings- und Validierungssätzen durchgeführt, um die Unabhängigkeit zwischen beiden Sätzen sicherzustellen und in jedem Schritt ein anderes Modell zu entwickeln. Die Gesamtleistung wurde dann als Mittelwert der Klassifizierungsleistungen der 10 separat entwickelten Modelle auf verschiedenen 10 %-Sätzen der Validierungsdaten berechnet, die nicht an der Entwicklung der Modelle beteiligt waren26. Die Präzision wurde im Hinblick auf Zwischenreproduzierbarkeitstests bewertet, indem der Variationskoeffizient (CV = SD/\(\stackrel{\mathrm{-}}{\text{x}}\)*100) für zehn Wiederholungen bei drei Messungen ermittelt wurde unterschiedliche Konzentrationsniveaus (0,5, 2,5 und 10 %), hergestellt mit unterschiedlichen Serumproben und gemessen von verschiedenen Bedienern. Die Linearität der Reaktion für alle entwickelten Methoden wurde für einen Hb-Gehalt von bis zu 10 % getestet, und die Nachweisgrenze (LOD) wurde mit dem Dreifachen und die LOQ mit dem Zehnfachen der Standardabweichung der zehn (n = 10) Serum-Leerwerte berechnet . Die Genauigkeit wurde durch Vergleich der mit jeder entwickelten Methode erhaltenen Hb-Konzentrationen mit denen der CNMHb-Methode bewertet.

Die Studie steht im Einklang mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften.

Die 49 Kalibrierungsproben wurden verwendet, um die Beziehung zwischen der Hb-Konzentration und der Absorption bei 540 nm in den Rinderserumproben zu bestätigen. Die Beziehung folgt dem Lambert-Beer-Gesetz und weist ein lineares Modell auf, das durch Absorption = (0,1051 ± 0,0075) + (0,0873 ± 0,0017) (Hb) mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,991 beschrieben wird (Abb. 3a). Dieses Ergebnis wurde auch durch ANOVA überprüft und die lineare Beziehung zwischen Absorption und Hb erwies sich als signifikant (P < 0,05).

(a) Kalibrierungskurve für die Hämoglobinkonzentration (Hb), erstellt aus dem Kalibrierungssatz für die direkte UV-VIS-spektrophotometrische Methode. (b) Vorhersage der Hämoglobinkonzentration (Hb) mithilfe der direkten UV-VIS-Spektrophotometriemethode für die Validierungsproben im Vergleich zu denen der CNMHb-Methode.

Nachdem die entsprechende lineare Beziehung zwischen Absorption und Hb-Konzentration in Rinderserumproben nachgewiesen wurde, wurden verschiedene Studien durchgeführt, um die analytischen Gütezahlen in Bezug auf Genauigkeit, Präzision, Linearität, LOD und Quantifizierungsgrenze (LOQ) der Methode zu ermitteln . Die Genauigkeit wurde durch Vorhersage der Hb-Konzentration in den 21 bekannten Proben im Validierungssatz bewertet. Nach Messung der Absorption bei 540 nm in diesen Proben wurde die erhaltene Kalibrierungskurve zur Vorhersage der Hb-Konzentration verwendet. Die mittels UV-VIS ermittelte Hb-Konzentration wurde gegen die mit der CNMHb-Methode gemessene Konzentration aufgetragen (Abb. 3b). Die lineare Regression ist wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Ansatz zum Vergleich verschiedener Analysemethoden. Basierend auf diesem Ansatz sollte die Regressionslinie zwischen der Test- und der Referenzmethode, wenn die beiden untersuchten Methoden vergleichbare Ergebnisse liefern, eine gerade Linie ergeben, die sich nicht wesentlich von der Gleichheitslinie unterscheidet (gekennzeichnet durch eine Steigung von 1 und einen Achsenabschnitt). gleich 0). Eine Abweichung von der Gleichheitslinie weist auf eine mangelnde Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden hin. Im vorliegenden Fall ergab die lineare Regression zwischen der durch UV-VIS ermittelten Hb-Konzentration und der durch die Referenzmethode erhaltenen Konzentration eine gerade Linie, für die die Regressionsgleichung der kleinsten Quadrate UV-VIS-Vorhersage = (0,0816 ± 0,1257) + ( 0,9688 ± 0,034) * (Hb), mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,988. Die resultierende Linie liegt nahe an der Gleichheitslinie: Die 95 %-Konfidenzintervalle für die Steigung (0,935–1,0032) und den Achsenabschnitt (− 0,0441–0,2073) umfassen die Werte 1,0 bzw. 0,0. Somit sind die Ergebnisse der UV-VIS-Messung mit denen der CNMHb-Methode vergleichbar. Um dieses Ergebnis zu verifizieren, wurde ein Paartest durchgeführt, der die mit den beiden Methoden erhaltenen Hb-Konzentrationen vergleicht. Für die 21 Proben im Validierungssatz betrug der Mittelwert der Differenz \({\overline{\text{X}}}\)d 0,0115 und die Standardabweichung der Differenz Sd betrug 0,455. Nach diesen Daten betrug der Wert von tcal = (\({\overline{\text{X}}}\)d \(\sqrt{\mathrm{n}}\))/Sd 0,116. Da tcal kleiner als t(95 %, n−1) ist, kann bestätigt werden, dass die UV-VIS-Methode Ergebnisse für Hb lieferte, die mit denen der Referenz-CNMHb-Methode vergleichbar sind, mit einem Signifikanzniveau von 0,05. Tatsächlich betrug die mittlere Wiederfindung der Proben nach der Validierung durch die UV-VIS-Bestimmungen 93,6 % (siehe Tabelle 1).

Bei der RGB-Methode wurden zwei unterschiedliche Kalibrierungsansätze angewendet: univariate Kalibrierung und multivariate Kalibrierung. Als die univariate Kalibrierung für die vier Farbparameter getestet wurde, die aus Bildern von Proben im Kalibrierungssatz extrahiert wurden, korrelierten die Werte von G, B und Intensität nicht gut mit der Hb-Konzentration. Die einzige Farbvariable, die einen linearen Zusammenhang mit der Hb-Konzentration aufwies, war die R-Variable (entsprechend den Rottönen). Dieses Ergebnis war zu erwarten, da die Farbe der Serumlösungen im roten Bereich liegt (von gelb-orange bis intensiv rot) (Abb. 1).

Mit dem Ziel, eine Kalibrierungskurve unter Verwendung eines analytischen Signals darzustellen, das dem für die UV-VIS-Methode erhaltenen ähnelt, wurde das rohe analytische R-Signal in Redbance (ähnlich der Absorption) umgewandelt und wie folgt berechnet:

Dabei ist R der Wert der extrahierten R-Daten für die betrachtete Probe und 256 die Gesamtzahl der RGB-Kanäle im roten Bereich. Unter Verwendung dieser Größe für das analytische Signal variiert die Redbance zwischen 0 für farblose Lösungen und 2,4 für die dunkelsten roten Lösungen. Gemäß diesem analytischen Signal folgte die Beziehung zwischen Redbance und der Hb-Konzentration in Serumproben von Rindern einer linearen Beziehung, beschrieben durch Redbance = (0,0929 ± 0,0021) + (0,0187 ± 0,0005) (Hb), mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,983. Wie jedoch aus diesen Ergebnissen hervorgeht und in Abb. 4a zu sehen ist, waren die Ergebnisse nicht so zufriedenstellend wie die UV-VIS-Ergebnisse und zeigten eine größere Datenstreuung für Kalibrierungsproben. Die Regressionsgerade für die ermittelte Hb-Konzentration und den Referenzwert (Abb. 4b) ist eine Gerade, die geringfügig von der Gleichheitsgeraden abweicht, und tatsächlich umfasst das Konfidenzintervall für die Steigung (0,824–0,914) a nicht Wert von 1,0. Dies führt zu einer Überschätzung der Hb-Konzentrationen bei Werten unter 5 % und zu einer Unterschätzung bei Werten über 5 %.

(a) Kalibrierungskurve für die Hämoglobinkonzentration (Hb), erstellt aus dem Kalibrierungssatz für die univariate RGB-Methode (R-basiert). (b) Vorhersage der Hämoglobinkonzentration (Hb) unter Verwendung der univariaten RGB-Methode (R-basiert) für die Validierungsproben im Vergleich zu denen der CNMHb-Methode.

Bei der multivariaten Kalibrierung wurden zwei unterschiedliche Verfahren verwendet, um das mathematische Modell zur Vorhersage der Hb-Konzentration im Serum basierend auf den vier Farbvariablen zu erstellen. Die erste basierte auf der PLS-Regression, während die zweite MLF-ANN verwendete.

PLSR wurde auf die 70 Proben der Datenmatrix mit den vier X-Variablen (R, G, B und gewichtete Intensität) und der Y-Antwort (Hb) angewendet. Die bisherige Trennung zwischen Kalibrierungs- und Validierungssätzen wurde gestrichen, da im vorliegenden Fall eine zehnfache Kreuzvalidierung durchgeführt wurde, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Das Modell wurde an den Trainingssatz angepasst, der aus 90 % der Proben bestand, und es wurde verwendet, um 10 % der Proben im Validierungssatz vorherzusagen. Der Vorgang muss zehnmal wiederholt werden, um sicherzustellen, dass alle Proben mindestens einmal im Validierungssatz enthalten sind (diese Validierungsstrategie ist offensichtlich mit einem hohen Rechenaufwand verbunden; dies ist jedoch für aktuelle Computerprozessoren und die modernen chemometrischen Pakete kein Problem). kann diesen Vorgang automatisieren). In der vorliegenden Studie wurde ein Drei-LF-Modellrang als optimal ausgewählt, der 99,9 bzw. 98,1 % der gesamten X- bzw. Y-Varianz beibehielt. Die erklärte Varianz für die Antwort in der Vorhersage betrug 97,6 %. Die vorhergesagten Werte für die Validierungsproben im Verhältnis zum Referenz-Hb-Wert sind in Abb. 5 dargestellt. Die Ergebnisse stellen eindeutig eine Verbesserung gegenüber dem univariaten Ansatz dar. Die erhaltene lineare Gleichung lautete: PLSR Predicted = (0,051 ± 0,0,069) + (0,9807 ± 0,0170) (Hb), R = 0,990. Wenn die erhaltene Gerade mit der Gleichheitsgeraden kompatibel ist (mit Steigung = 1 und Achsenabschnitt = 0), bedeutet dies, dass die RGB-PLSR-Methode vergleichbare Ergebnisse wie die Referenzmethode liefert. Zur Verifizierung dieses Endpunkts wurde ein Test angewendet, der auf der Definition eines gemeinsamen Konfidenzbereichs für den Achsenabschnitt βo und die Steigung β1 (bei der es sich um eine Ellipse handelt) basiert. Im vorliegenden Fall umfasste der erhaltene 95 %-Konfidenzbereich Werte von βo = 0 und β1 = 1. Dann erzielte die RGB-PLSR-Methode mit einem Konfidenzniveau von 95 % kompatible Ergebnisse mit der Referenz-CNMHb-Methode für die Hämoglobinmessung. Somit enthalten die vier Farbvariablen zusammen genügend Informationen, um die Hb-Konzentration angemessen vorherzusagen. In einem Versuch, die Vorhersagekapazität der RGB-basierten Modelle zu verbessern, wurde eine weitere multivariate Kalibrierung unter Verwendung eines mehrschichtigen künstlichen neuronalen Feed-Forward-Netzwerks erstellt.

Vorhersagen der Hämoglobinkonzentration (Hb) mithilfe der RGB-PLSR-Methode für die Validierungsproben im Vergleich zu denen der CNMHb-Methode.

In diesem Abschnitt wurde ein MLF-ANN verwendet, um die Hb-Konzentration auf der Grundlage der Rohdaten für dieselben vier Farbvariablen vorherzusagen. Die neuronale Architektur für das MLF-Netzwerk wurde wie folgt ausgewählt. Die Eingabeschicht bestand aus vier Neuronen (eine Zahl, die der Anzahl der Eingabefarbvariablen entsprach), und die Ausgabeschicht wurde aus einem Neuron gebildet, was den vom Netzwerk vorhergesagten Hb-Wert ergab. Die Anzahl und Größe der verborgenen Schichten wurde auf der Grundlage des minimalen quadratischen Mittelfehlers (RSE) für den gesamten Datensatz ausgewählt. Der niedrigste RSE wurde mit einem neuronalen Netzwerk mit drei Schichten (4–7-1) erreicht und für weitere Berechnungen verwendet. Andere Netzwerkarchitekturen mit zwei verborgenen Schichten stellten ein ähnliches RSE bereit, aber die einfachste Struktur mit drei Schichten wurde bevorzugt. Die für die Ausgabeberechnungen verwendete Übertragungsfunktion war sigmoidal: f(x) = 1/(1 + [exp(–x)]). Die Anfangsgewichte der Verbindungen zwischen Neuronen wurden zufällig im Bereich von 3 bis −3 ausgewählt. Der adaptive Lernratenparameter η und der Impuls i (die Parameter, die das Gewicht der Verbindungen nach jeder Epoche aktualisieren) betrugen 0,2 bzw. 0,5 und die Die maximale Anzahl Epochen wurde auf 500 begrenzt, um eine Überanpassung zu verhindern. Zur Validierung wurde eine zehnfache Kreuzvalidierung wie oben beschrieben durchgeführt. Die von MLF-ANN vorhergesagten Serum-Hb-Konzentrationen sind in Abb. 6 dargestellt. Das ANN liefert noch bessere Ergebnisse als PLSR. Der Vergleich zwischen den ANN-Vorhersagewerten und der Referenz-Hb-Konzentration war angemessen und folgte einer angepassten Linie ANN-Vorhersage = (0,0270 ± 0,0348) + (0,9916 ± 0,0083) (Hb) mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,997. Die Kompatibilität mit der Gleichheitslinie wurde mit dem gleichen Test wie im vorherigen Abschnitt positiv nachgewiesen. Somit ist das optimierte neuronale Netzwerk in der Lage, nützliche Informationen aus rohen Farbdaten zu extrahieren und die Hb-Konzentration in Serumproben korrekt vorherzusagen, wie sie mit der Referenz-CNMHb-Methode bestimmt wird.

Vorhersagen der Hämoglobinkonzentration (Hb) mithilfe der RGB-MLF-ANN-Methode für die Validierungsproben im Vergleich zu denen der CNMHb-Methode.

Zusätzlich zur Bewertung der Genauigkeit, ausgedrückt in Form der Vorhersagekapazität der oben beschriebenen Methoden, wurden andere analytische Gütefaktoren wie Präzision bei drei Konzentrationsniveaus, LOD und Linearität getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die UV-VIS-Methode lieferte im Vergleich zum CNMHb-Verfahren ausreichende Ergebnisse. Daher ist die Messung der Absorption bei 540 nm eine schnelle und einfache Methode zur Abschätzung der Hämolyse in Rinderserum. Der LOD war der niedrigste aller entwickelten Verfahren und die Linearität der Absorption im Verhältnis zur tatsächlichen Hb-Konzentration betrug bis zu 10 %. Die univariate RGB-Methode, die auf der als Redbance gemessenen Reaktion in den roten Kanälen basiert, lieferte unbefriedigende Ergebnisse, da die Vorhersagen für Validierungsproben den Hb-Gehalt für niedrige Werte überschätzten und hohe Werte unterschätzten. Auch diese direkte farbbasierte univariate Methode lieferte schlechte Ergebnisse hinsichtlich der Präzision (insbesondere bei Konzentrationswerten unter 1 %). Somit verbesserte der RGB-multivariate Ansatz die erzielten Ergebnisse. Die in beiden multivariaten RGB-Methoden basierenden Vorhersagen auf der Grundlage von PLSR- und MLF-ANN-Kalibrierungen führten zu ähnlichen Ergebnissen wie die CNMHb-Methode. Allerdings waren die Genauigkeit der Vorhersagen durch die PLSR-Methode und folglich die Wiederfindungen durch diese Methode bei niedrigen Werten sehr schlecht. Im Gegensatz dazu lieferte die Kalibrierung mithilfe eines neuronalen Netzwerks ausreichende Präzisionsergebnisse mit einem CV im Bereich von 0,10–5,56 %. Darüber hinaus ergab die lineare Reaktion für die RGB-ANN-Methode bis zu 10 % Hb und die mittlere Wiederherstellung im Vergleich zur CNMHb-Methode betrug 102,3 %.

Es wurden zwei farbbasierte Methoden zur Bestimmung der Hämolyse in Rinderserumproben durch Messung der Hb-Konzentration getestet. Sowohl die direkte UV-VIS-Spektralphotometrie als auch die RGB-MLF-ANN-Methode lieferten zufriedenstellende Ergebnisse und lieferten Ergebnisse, die statistisch mit denen der CNMHb-Referenzmethode vergleichbar waren (P < 0,05). In beiden Fällen waren die Gütewerte ausreichend und eine Hämolyse wurde bei 0,50 g L–1 festgestellt, dem Mindestwert, der normalerweise die Ergebnisse von Blutuntersuchungen beeinflusst17.

Es wurden viele Methoden zur Hb-Messung entwickelt, da Hb zur Anzeige von Anämie und In-vitro-Hämolyse verwendet wird, die beide wichtig sind und in der Humanmedizin häufig vorkommen. In der Vergangenheit stützte sich die Hb-Messung auf gut ausgestattete Labore und den Einsatz chemischer Verfahren wie der CNMHb-Methode, der Referenzmethode zur Bestimmung von Hb-Konzentrationen gemäß dem Internationalen Komitee für Standardisierung in der Hämatologie (ICSH)27. Dieser Ansatz basiert auf der Messung der Absorption bei 540 nm des stabilsten Hb-Derivats, Cyanmethämoglobin28. Allerdings empfiehlt das ICSH die Verwendung dieser Methode nur durch nationale Komitees zur Standardisierung hämatologischer Methoden oder durch von der Regierung ernannte offizielle Inhaber. Der Einsatz dieser Methode im Hämolysetest ist nicht möglich, da sie zeitaufwändig ist und toxische Rückstände erzeugt. Dennoch wird die Methode in einigen Ländern immer noch häufig angewendet29.

Aufgrund der hohen Häufigkeit und Bedeutung dieses Phänomens in der klinischen Pathologie streben Labore weltweit heute danach, Hämolyse in Proben systematisch nachzuweisen. Da das Verfahren in allen Arten von Laboren durchgeführt werden soll, werden schnellere und einfachere Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung der Hämolyse entwickelt. Die Spektrometrie gilt als die beste Methode zur Bewertung von freiem Hb, und obwohl die standardmäßige Verwendung von HI in mehreren Leitlinien vorgeschlagen wird2,30, besteht die allgemeine Auffassung, dass diese Empfehlung nicht vollständig bewertet wurde19. Das HI berechnet den Grad der Hämolyse, indem es die Absorption von Serum- oder Plasmaproben bei verschiedenen Wellenlängenpaaren (z. B. 570 und 600 nm oder 660 und 700 nm) misst. Diese Methode ist mittlerweile in den meisten großen Workstations integriert. Eine Reihe spektrometrischer Methoden verwenden zwei oder mehr Wellenlängen in Gelbsucht- oder lipämischen Proben, um die bei Ergebnissen mit einer Wellenlänge beobachteten Interferenzen zu verhindern.

In einer klassischen Studie verglichen Malinauskas et al.31 anhand von Rinderproben neun verschiedene spektrophotometrische Methoden, bei denen zwei und drei kombinierte Wellenlängen sowie zwei weitere chemische Methoden zur Messung von Hb im Plasma zum Einsatz kamen. Diese Autoren kamen zu dem Schluss, dass spektrometrische Methoden sicherer, einfacher sowie präziser und genauer seien als Methoden, die den Zusatz von Chemikalien beinhalten. Diese unterschiedlichen Ansätze sind möglich, da Hb-Absorptionsspektren die Abschätzung von Hb in einem breiten Wellenlängenbereich mit mindestens zwei charakteristischen Hauptmaxima bei etwa 420 und 540 nm ermöglichen32. Der 540-nm-Peak wurde für die Entwicklung der UV-VIS-direkten spektrophotometrischen Methode in dieser Studie ausgewählt, da in anderen Studien gute Ergebnisse zur Beurteilung der Hämolyse bei Menschen und anderen Tierarten erzielt wurden7,33,34,35. Es wurden auch andere Wellenlängen in der Nähe dieser Hauptpeaks verwendet. In der Humanmedizin hat sich ein spektrophotometrischer Ansatz auf der Grundlage von λ = 414 nm zur Messung geringer Hämolysewerte im Serum als zuverlässige Methode zur Identifizierung hämolytischer Proben erwiesen36. In diesem Fall ermöglichte die vorgeschlagene Methode den Nachweis einer Hämolyse von 0,004 %. Andere Autoren, die die möglichen Schwankungen der Absorptionspeaks von Hb auf der Grundlage des Sauerstoffpartialdrucks (PO2) untersucht haben, kamen zu dem Schluss, dass der Peak bei 576 ebenfalls nützlich sein könnte, wenn der PO2 höher als 100 mm Hg ist37. Es wurden nur geringfügige Unterschiede in den Absorptionsspektren von menschlichem und bovinem Oxyhämoglobin gefunden38, und daher sollten die in diesen Studien verwendete Analysetechnik und Wellenlänge auch bei bovinen Patienten gültig sein, wie für die hier vorgestellte UV-VIS-Methode gezeigt. Bei dieser ersten Methode war die univariate Kalibrierung der Absorption bei 540 nm gegenüber dem Hb-Gehalt unserer Erfahrung nach ausreichend für eine gute Vorhersage der Hämolyse in den Rinderserumproben. Einige Schwächen des entwickelten Ein-Wellenlängen-Ansatzes umfassen jedoch die folgenden Aspekte: (1) Die mit einer einzelnen Wellenlänge durchgeführte Kalibrierung kann möglicherweise nicht unterscheiden, ob das analytische Signal nur vom Zielanalyten (in diesem Fall Hb) stammt oder von einem in der Matrix (Serum) vorhandenen Störstoff, der das gemessene Signal erhöhen oder verringern kann; und (2) die Schwierigkeit bei der Durchführung von Feldmessungen und die möglichen Störungen durch die Änderung der Serumfarbe in lipämischen und ikterischen Proben. Trotz dieser Überlegungen wird auf der Grundlage der erzielten Ergebnisse das hier angewandte Verfahren auf Basis einer einzigen Wellenlänge als angemessen erachtet, da es sich nicht nur um eine validierte, sondern auch um eine einfache, schnelle, wirtschaftliche, zerstörungsfreie und verfügbare Messtechnik handelt Hämolyse in Rinderserumproben.

Angesichts der Tatsache, dass spektrophotometrische Methoden für Fachleute unter Feldbedingungen oder für kleine Veterinärlabore möglicherweise nicht durchführbar sind, wurde eine zweite Methode entwickelt, die auf RGB-Daten basiert, die aus einem digitalen Bild von Proben extrahiert wurden, die mit einem einfachen digitalen Gerät aufgenommen wurden. Die Implementierung dieser Methode auf einem Mobiltelefon oder einem anderen mobilen Gerät wäre für Außendienstmitarbeiter ein wertvolles Werkzeug, um die Qualität der Probe zu überprüfen, bevor sie an spezialisierte Labore gesendet wird. Von den verschiedenen bewerteten Ansätzen lieferte die multivariate RGB-MLF-ANN-Methode die besten Ergebnisse für die Bestimmung von Hb. Obwohl die analytischen Gütezahlen für RGB-MLF-ANN etwas schlechter waren als die der UV-VIS-Methode (geringere Präzision für 2,5 % Hämolyse und etwas höhere LOD), waren die mit diesem Verfahren erzielten Ergebnisse ebenfalls akzeptabel und denen ähnlich erhalten durch die CNMHb-Methode (P < 0,05). Das Verfahren kann daher zur zuverlässigen Messung der Hämolyse eingesetzt werden. Gängige Werkzeuge wie Digitalkameras und Telefone werden zunehmend im wissenschaftlichen Bereich eingesetzt, da diese relativ kostengünstigen Instrumente die für solche Aufgaben erforderliche Hardware und Software enthalten. RGB-Daten wurden verwendet, um verschiedene analytische Aufgaben zu erfüllen, wie zum Beispiel die Erkennung von Verfälschungen in altem Wein23 und die Bestimmung des Eisengehalts in Blut, Wein und Wasser39. In der Veterinärwissenschaft ermöglichen Kameras, die RGB-Daten liefern, unter anderem die Entwicklung von Methoden zur Identifizierung einzelner Kühe40,41, zur Messung und Steuerung des Herzschlags von Rindern42, zum Teilen von Fleisch und Eingeweiden bei Geflügel43 und zur Erkennung von verdorbener Hähnchenbrust44. Im medizinischen Bereich nutzen verschiedene Geräte Spektrometrie oder RGB-Daten zur Bestimmung von Hb beim Menschen, sowohl mit invasiven45,46 als auch mit nicht-invasiven Methoden47,48,49,50. Die meisten dieser Instrumente und Geräte wurden für die Erkennung von Anämie bei menschlichen Patienten entwickelt, es wurden jedoch auch auf RGB-Telefonen basierende Methoden zur Erkennung von In-vitro- und In-vivo-Hämolyse eingesetzt51. Archibong et al.52 verwendeten RGB-Werte, um eine In-vivo-Hämolyse mit einer Mobiltelefonmethode zu erkennen, mit einer Genauigkeit von 0,01 g L–1 Hb in Plasmaproben und einem Korrelationskoeffizienten von R2 = 0,9703. Lopes et al.53 entwickelten eine Methode, die Computer Vision und neuronale Netze (NN) umfasst. Nach dem Training des NN wurden Werte von 0,4 g L–1 Hb ermittelt. Das Gerät schätzte die Hämolyse mit ausreichender Genauigkeit, um die Entscheidung des Labors in der voranalytischen Phase des Bluttests zu leiten. Die Verwendung von NN bietet Vorteile für die Dateninterpretation hinsichtlich Nichtlinearität, überwachtem Lernen, Anpassungsfähigkeit und Kontextinformationen. Aus diesen Gründen wurden NNs als multivariates Vorhersagetool zur Bewertung der Probenhämolyse sowie anderer bekannter Kalibrierungsansätze wie der partiellen kleinsten Quadrate-Regression (PLSR) verwendet. So verwendeten Kim et al.54 PLRS zufriedenstellend, um den Hb-Spiegel im Blut durch rekonstruierte Reflexionsspektren aus RGB-Daten zu quantifizieren, die vom dritten Auge von Rindern mit einer Dreifarben-Sensorkamera erhalten wurden. In dieser Studie ermittelten die Autoren auch nur die Korrelationen für den R-Kanal zur Bestimmung von Blut-Hb und kamen zu dem Schluss, dass dieser Kanal zwar mit Hb assoziiert war (P = 0,047), der Korrelationskoeffizient jedoch zu niedrig war. Dieser Befund stützt die Idee, dass der R-Kanal zwar möglicherweise mit dem Hb-Gehalt in Zusammenhang steht, die Anwendung eines multivariaten Ansatzes jedoch erforderlich ist, um konsistente, belastbare Ergebnisse zu erzielen. In der hier evaluierten univariaten RGB-Methode wurde auch die ausschließliche Verwendung des R-Kanals untersucht (da aufgrund der roten Farbe eine Beziehung zu Hb erwartet wird). Obwohl die Ergebnisse besser waren als die von Kim et al.54 (R2 = 0,973 für das direkte R-Kanal-Verfahren im Vergleich zu R2 = 0,260 für das R-Kanal-Verfahren), fehlte es an ausreichender Präzision (mit einer hohen Datenstreuung). für Kalibrierproben) sowie die Überschätzung der Hb-Konzentrationen bei Werten unter 5 % und die Unterschätzung bei Werten über 5 % schließen den Einsatz dieser Methode aus. Der Ansatz, der die Verwendung eines mehrschichtigen neuronalen Netzwerks mit Vorwärtslernen beinhaltet, könnte zur Entwicklung neuer Verfahren auf Basis kostengünstiger Kameras (mit höherer Auflösung als die in dieser Arbeit verwendeten) oder sogar Mobiltelefonanwendungen zur Erkennung und Quantifizierung von Hämolyse bei Rindern genutzt werden aus digitalen Bildern. Damit steht den in diesem Bereich tätigen Veterinärmedizinern ein einfaches, schnelles und benutzerfreundliches Tool zur schnellen Abschätzung des Hämolysegrades in Rinderproben zur Verfügung.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Simundic, AM, Baird, G., Cadamuro, J., Costelloe, SJ & Lippi, G. Verwaltung hämolysierter Proben in klinischen Labors. Krit. Rev. Clin. Labor. Wissenschaft. 57, 1–21 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lippi, G., Cadamuro, J., Von Meyer, A. & Simundic, AM Praktische Empfehlungen für den Umgang mit hämolysierten Proben in klinischen Chemietests. Klin. Chem. Labor. Med. 56, 718–727 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Braun, JP, Bourgès-Abella, N., Geffré, A., Concordet, D. & Trumel, C. Die präanalytische Phase in der veterinärmedizinischen klinischen Pathologie. Tierarzt. Klin. Pathol. 44, 8–25 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Šimundić, AM, Nikolac, N. & Guder, WG Präanalytische Variations- und Voruntersuchungsprozesse. In Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics (Hrsg. Rifai, N. et al.) 81–94 (Elsevier, 2018).

Google Scholar

Di Martino, G. et al. Der Grad der Akzeptanz von Schweineblutwerten bei steigenden Hämolysegraden wurde durch visuelle Inspektion im Vergleich zur automatisierten Quantifizierung bewertet. J. Tierarzt. Diag. Investig. 27, 306–312 (2015).

Artikel Google Scholar

Jacobs, RM, Lumsden, JH & Grift, E. Auswirkungen von Bilirubinämie, Hämolyse und Lipämie auf klinische Chemieanalyten in Rinder-, Hunde-, Pferde- und Katzenseren. Dürfen. Tierarzt. J. 33, 605–608 (1992).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Killilea, DW et al. Identifizierung einer Hämolyseschwelle, die die Zinkkonzentration im Plasma und Serum erhöht. J. Nutr. 147, 1218–1225 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koseoglu, M., Hur, A., Atay, A. & Çuhadar, S. Auswirkungen von Hämolyseinterferenzen auf routinemäßige biochemische Parameter. Biochem. Medica 21, 79–85 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Leard, BL, Alsaker, RD, Porter, WP & Sobel, LP Die Wirkung der Hämolyse auf bestimmte Parameter der Hundeserumchemie. Labor. Anim. 24, 32–35 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

O'Neill, SL & Feldman, BF Hämolyse als Faktor in der klinischen Chemie und Hämatologie des Hundes. Tierarzt. Klin. Pathol. 18, 58–68 (1989).

Artikel PubMed Google Scholar

Larrán, B. et al. Einfluss der Hämolyse auf das Mineralstoffprofil von Rinderserum. Anim. 11, 3336 (2021).

Artikel Google Scholar

Sodi, R., Darn, SM, Davison, AS, Stott, A. & Shenkin, A. Mechanismus der Interferenz durch Hämolyse im kardialen Troponin-T-Immunoassay. Ann. Klin. Biochem. 43, 49–56 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nougier, C., Jousselme, E., Sobas, F., Pousseur, V. & Négrier, C. Auswirkungen von Hämolyse, Bilirubin und Lipämieinterferenz auf Gerinnungstests, die von zwei Analysesystemen erfasst wurden. Int. J. Lab. Hämatol. 42, 88–94 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Hawkins, R. Diskrepanz zwischen visueller und spektrophotometrischer Beurteilung der Probenhämolyse. Ann. Klin. Biochem. 42, 521–522 (2002).

Artikel Google Scholar

Simundic, AM et al. Vergleich der visuellen mit der automatischen Erkennung lipämischer, ikterischer und hämolysierter Proben: Können wir uns auf das menschliche Auge verlassen? Klin. Chem. Labor. Med. 47, 1361–1365 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Luksic, AH et al. Die visuelle Beurteilung der Hämolyse wirkt sich auf die Patientensicherheit aus. Klin. Chem. Labor. Med. 56, 574–581 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lippi, G. & Cadamuro, J. Visuelle Beurteilung der Probenqualität: Quo usque tandem?. Klin. Chem. Labor. Med. 56, 513–515 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gomez Rioja, R. et al. Hämolyse in diagnostischen Proben. Rev. des Labors. Klin. 2, 185–195 (2009).

Google Scholar

Lippi, G. Systematische Bewertung des Hämolyseindex: Vor- und Nachteile. Adv. Klin. Chem. 71, 157–170 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri= CELEX%3A02010L0063-20190626 (2010).

Königlicher Erlass 53/2013 vom 1. Februar, der die Grundregeln für den Schutz von Tieren festlegt, die für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke, einschließlich Unterricht, verwendet werden. https://www.boe.es/buscar/act.php?id=BOE-A-2013-1337 (2013).

Jerry Kaneko, J., Harvey, JJ & Bruss, ML Clinical Biochemistry of Domestic Animals (Academic Press, 2008).

Google Scholar

Herrero-Latorre, C., Barciela-García, J., García-Martín, S. & Peña-Crecente, RM Erkennung und Quantifizierung von Verfälschungen in gereiftem Wein mithilfe digitaler RGB-Bilder in Kombination mit multivariaten chemometrischen Techniken. Lebensmittelchem. X 3, 100046 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Geladi, P. & Kowalski, BR Partielle Regression der kleinsten Quadrate: Ein Tutorial. Anal. Chim. Acta 185, 1–17 (1986).

Artikel CAS Google Scholar

Zupan, J. & Gasteiger, J. Neural Networks for Chemistry and Drug Design: An Introduction (Wiley-VCH, 1999).

Google Scholar

Vabalas, A. Validierung von Algorithmen für maschinelles Lernen mit einer begrenzten Stichprobengröße. PLoS ONE 14, e0224365 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Internationales Komitee für Standardisierung in der Hämatologie. Br. J. Hämatol. 13, 71–75 (1967).

Artikel Google Scholar

van Kampen, EJ & Zijlstra, WG Standardisierung der Hämoglobinometrie II. Die Hemiglobincyanid-Methode. Klin. Chim. Acta 6, 538–544 (1961).

Artikel PubMed Google Scholar

Srivastava, T., Negandhi, H., Neogi, SB, Sharma, J. & Saxena, R. Methoden zur Hämoglobinschätzung: Ein Überblick darüber, „was funktioniert“. J. Hämatol. Transfus. 2, 2005–2006 (2014).

Google Scholar

Smith, MB et al. Hämolyse-, Ikterus- und Lipämie-/Trübungsindizes als Indikatoren für Störungen in der klinischen Laboranalyse. Klin. Labor. Stand. Inst. 32, 1–35 (2012).

Google Scholar

Malinauskas, RA Plasma-Hämoglobin-Messtechniken zur In-vitro-Bewertung von Blutschäden durch medizinische Geräte. Artif. Organs 21, 1255–1267 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A. & Müller, G. Optische Eigenschaften von zirkulierendem menschlichem Blut im Wellenlängenbereich 400–2500 nm. J. Biomed. Opt. 4, 36–46 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Taparia, N., Platten, KC, Anderson, KB & Sniadecki, NJ Ein mikrofluidischer Ansatz für den Hämoglobinnachweis im Vollblut. AIP Adv. 7, 105102 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Merchant, M., Hammack, T., Sanders, P. & Dronette, J. Schnelle und kostengünstige Methode zur spektroskopischen Bestimmung der angeborenen Immunaktivität von Krokodilen. Spektroskopie Lette. 39, 337–343 (2006).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Vieira, TO & Diré, GF Spektrophotometrische und hämolytische Analyse eines Extrakts von Costus spicatus. EJBMSR 3, 29–58 (2015).

Google Scholar

Shah, JS, Soon, PS & Marsh, DJ Vergleich von Methoden zum Nachweis geringer Hämolysewerte im Serum zur genauen Beurteilung von Serum-microRNAs. PLoS ONE 11, e0153200 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Liu, P., Zhu, Z., Zeng, C. & Nie, G. Spezifische Absorptionsspektren von Hämoglobin bei verschiedenen PO2-Werten: Mögliche nichtinvasive Methode zum Nachweis von PO2 in Geweben. J. Biomed. Opt. 17, 125002 (2012).

Artikel ADS PubMed CAS Google Scholar

Zijlstra, WG & Buursma, A. Spektrophotometrie von Hämoglobin: Absorptionsspektren von bovinem Oxyhämoglobin, Desoxyhämoglobin, Carboxyhämoglobin und Methämoglobin. Komp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 118, 743–749 (1997).

Artikel Google Scholar

Vallejos, S. et al. Feste sensorische Polymersubstrate zur Quantifizierung von Eisen in Blut, Wein und Wasser mittels einer skalierbaren RGB-Technik. J. Mater. Chem. A 1, 15435–15441 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Andrew, W., Hannuna, S., Campbell, N. & Burghardt, T. Automatische Identifizierung einzelner holsteinfriesischer Rinder durch selektiven lokalen Fellmusterabgleich in RGB-D-Bildern. In Proceedings of the IEEE International Conference on Image Processing (ICIP), Band 2016 – August 484–488 (IEEE Computer Society, 2016).

Bhole, A., Falzon, O., Biehl, M. & Azzopardi, G. Eine Computer-Vision-Pipeline, die Wärme- und RGB-Bilder zur Erkennung von Holstein-Rindern verwendet. In „Vorlesungsunterlagen zur Informatik“ (einschließlich der Unterreihen „Vorlesungsunterlagen zur Künstlichen Intelligenz“ und „Vorlesungsunterlagen zur Bioinformatik“) Bd. 11679 108–119 (Springer Verlag, 2019).

Jorquera-Chavez, M. et al. Modellierung und Validierung von Computer-Vision-Techniken zur Beurteilung von Herzfrequenz, Augentemperatur, Ohrbasistemperatur und Atemfrequenz bei Rindern. Tiere 9, 1089 (2019).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Philipsen, MP, Dueholm, JV, Jørgensen, A., Escalera, S. & Moeslund, TB Organsegmentierung in Geflügeleingeweiden mittels RGB-D. Sensoren (Schweiz) 18, 117 (2018).

Artikel ADS Google Scholar

Lee, K., Baek, S., Kim, D. & Seo, J. Ein Frischeindikator zur Überwachung des Verderbs von Hähnchenbrust mithilfe einer Tyvek®-Folie und RGB-Farbanalyse. Lebensmittelverpackung. Haltbarkeit 19, 40–46 (2019).

Artikel Google Scholar

Tyburski, EA et al. Die Einwegplattform bietet visuelle und farbbasierte Vor-Ort-Anämie-Selbsttests. J. Clin. Investieren. 124, 4387–4394 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Edwards, P. et al. Smartphone-basiertes optisches Spektrometer zur spektroskopischen Messung des Hämoglobins mit diffuser Reflexion. Wissenschaft. Rep. 7(1), 12224 https://doi.org/10.1038/s41598-017-12482-5 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Collings, S. et al. Nicht-invasive Erkennung von Anämie anhand digitaler Aufnahmen der Bindehaut. PLoS ONE 11, e0153286 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hasan, MK, Sakib, N., Love, RR & Ahamed, SI RGB-Pixelanalyse eines Fingerspitzen-Videobilds, aufgenommen von einem Sichelzellenpatienten mit niedrigem und hohem Hämoglobinspiegel im Jahr 2017, IEEE 8th Annual Ubiquitous Computing, Electronics and Mobile Communication Conference, UEMCON 2017 Bd. 2018 499–505 (Institute of Electrical and Electronics Engineers Inc., 2017).

Noriega, LM, Rojas, PW & Silva, AS Hämoglobin-Screening mithilfe cloudbasierter mobiler Fotoanwendungen. Ing. y Univ. 23(2), 1–22 https://doi.org/10.11144/Javeriana.iyu23-2.hsuc (2019).

Artikel Google Scholar

Jayakody, JADCA, Edirisinghe, EAGA & Lokuliyana, S. HemoSmart: Ein nichtinvasives Gerät und eine mobile App zur Anämieerkennung. In Cognitive Engineering for Next Generation Computing 93–119 (Wiley, 2021). doi:https://doi.org/10.1002/9781119711308.ch3

Rajmanova, P., Vala, D. & Slanina, Z. Erkennung von hämolytischen Transfusionsbeuteln in IFAC Proceedings Volumes (IFAC-PapersOnline) vol. 12 400–404 (IFAC-Sekretariat, 2013).

Archibong, E., Konnaiyan, KR, Kaplan, H. & Pyayt, A. Ein mobiltelefonbasierter Ansatz zur Erkennung von Hämolyse. Biosens. Bioelektron. 88, 204–209 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lopes, KM et al. Tragbares Gerät zur Messung hämolysierter Blutproben basierend auf Computer Vision und neuronalem Netzwerk. J. Med. Gerätetrans. ASME 13, 1–25 (2019).

Google Scholar

Kim, T. et al. Auf dem Weg zu einer mit Laborblutuntersuchungen vergleichbaren photometrischen Beurteilung von Anämie in der Veterinärhämatologie. J. Biomed. Opt. 21, 107001 (2016).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

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Die Autoren danken den Mitarbeitern des Veterinärlehrkrankenhauses Rof-Codina und des RIAIDT-USC der Universität Santiago de Compostela für die Nutzung der klinischen und analytischen Einrichtungen.

Abteilung für Anatomie, Tierproduktion und klinische Veterinärwissenschaften, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, Spanien

Belén Larrán, Marta Miranda, Lucas Rigueira und María Luisa Suárez

Veterinärmedizinisches Lehrkrankenhaus „Rof-Codina“, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, Spanien

Belén Larrán, Marta Miranda, Lucas Rigueira und María Luisa Suárez

Abteilung für Tierpathologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, Spanien

Marta López-Alonso & Víctor Pereira

Forschungsinstitut für chemische und biologische Analyse, Abteilung für analytische Chemie, Ernährung und Bromatologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, Spanien

Carlos Herrero-Latorre

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BL, MLA, MM und CHL konzipierten das Experiment und BL, MLA, MM, CHL, VP, MLS und LR führten das Experiment durch und waren an der Probenentnahme beteiligt. Die Daten wurden von CHL statistisch analysiert und das Manuskript wurde von BL, MLA und CHL verfasst. Alle Autoren haben die endgültige Version des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Marta Miranda.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Larrán, B., López-Alonso, M., Miranda, M. et al. Messung der Hämolyse in Rinderserum mit direkten UV-VIS- und RGB-Digitalbildmethoden. Sci Rep 12, 13523 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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Eingegangen: 21. Dezember 2021

Angenommen: 02. August 2022

Veröffentlicht: 08. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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Messung der Hämolyse in Rinderserum durch direktes UV