Optimierung eines Hochs

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4588 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Für eine detaillierte Bewertung der direkten und indirekten Auswirkungen der routinemäßigen Pneumokokken-Konjugatimpfung (PCV) sind empfindliche Instrumente zum Nachweis gleichzeitig kolonisierender Pneumokokken-Serotypen erforderlich. Ein quantitatives nanofluidisches Echtzeit-PCR-Reaktionsset (Standard BioTools „Fluidigm“) mit hohem Durchsatz wurde entwickelt, um 92 Pneumokokken-Serotypen in archivierten klinischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren. Zum Vergleich wurden Nasopharynxabstriche verwendet, die in den Jahren 2009–2011 von südafrikanischen Kindern ≤ 5 Jahren entnommen und zuvor mit Standardmethoden auf Kulturbasis serotypisiert wurden. Der Reaktionssatz innerhalb des „Fluidigm“ verstärkte effektiv alle Ziele mit hoher Effizienz (90–110 %), Reproduzierbarkeit (R2 ≥ 0,98) und einer niedrigen Nachweisgrenze (< 102 KBE/ml). Eine Blindanalyse von 1.973 Nasopharyngealabstrichproben ergab eine diagnostische Sensitivität von > 80 % und eine Spezifität von > 95 % im Vergleich zur Referenzstandardmethode, der kulturbasierten Quellung-Methode. Mit der qPCR-Methode konnten Pneumokokkentypen mit guter Unterscheidung im Vergleich zu Quellung serotypisiert werden (ROC-AUC: > 0,73). Die nanofluidische Echtzeit-PCR-Methode mit hohem Durchsatz weist innerhalb eines einzigen qPCR-Laufs gleichzeitig 57 einzelne Serotypen und 35 Serotypen innerhalb von 16 Serogruppen in 96 Proben (einschließlich Kontrollen) nach. Diese Methode kann verwendet werden, um den Einfluss aktueller PCV-Formulierungen auf die Kolonisierung von Impfstoff-Serotypen und Nicht-Impfstoff-Serotypen zu bewerten, einschließlich der Erkennung mehrerer gleichzeitig kolonisierender Serotypen. Unsere qPCR-Methode kann die Überwachung der serotypspezifischen Bakterienlast sowie des Auftretens oder der laufenden Übertragung kleinerer oder kokolonisierender Serotypen ermöglichen, die möglicherweise ein invasives Krankheitspotenzial haben.

Die Kapsel von Streptococcus pneumoniae besteht aus sich wiederholenden Polysacchariden, die genetisch durch den Capsular Polysaccharide Synthesis (CPS)-Locus kodiert werden, der Serotyp-Heterogenität verleiht1,2. Es gibt 100 biochemisch und serologisch unterschiedliche Serotypen von S. pneumoniae3. Die Kapselvielfalt ist ein wichtiger Virulenzfaktor bei S. pneumoniae4 und die Serotypen haben ein unterschiedliches Potenzial, beim Menschen Krankheiten zu verursachen5. Pneumokokken-Konjugat-Impfstoffe (PCV) verhindern die Übertragung des Pneumokokken-Impfstoff-Serotyps (VT), der eine Vorstufe der Krankheit darstellt6,7,8,9,10. Das erste zugelassene PCV (PCV7) zielte auf sieben Serotypen ab, nämlich: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F und 23F. Zu den derzeit in unserem Umfeld verwendeten PCVs gehören zusätzlich drei (PCV10: 1, 5 und 7F) und sechs (PCV13: 1, 3, 5, 6A, 7F und 19A) Serotypen. 15- und 20-valente PCVs der nächsten Generation befinden sich in klinischen Studien und umfassen im Vergleich zu PCV13 zusätzlich zwei (22F und 33F)11 bzw. sieben (8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F und 33F)12 Serotypen.

Die Überwachung der Pneumokokken-Besiedlung der oberen Atemwege ist nützlich, um die Auswirkungen der PCV-Impfung auf Bevölkerungsebene zu beurteilen13. Untersuchungen zur Besiedelung von Pneumokokken lassen sich am besten mit umfassenden, empfindlichen und genauen Serotypisierungsmethoden durchführen, die die gleichzeitige Übertragung mehrerer Serotypen, einschließlich VT und Nicht-Impfstoff-Serotypen (NVT), erkennen können. Eine konsequente Überwachung zirkulierender Serotypen ist erforderlich, um Impfstrategien und die Verwendung von PCVs mit höherer oder alternativer Wertigkeit zu informieren, auch wenn diese auf verschiedene geografische Regionen zugeschnitten sind. und zum Nachweis neu auftretender oder ersetzender Serotypen13.

Kulturbasierte Quellung-Methoden bleiben der Goldstandard für die Serotypisierung von S. pneumoniae; Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig, weisen eine geringe Empfindlichkeit auf und sind kostspielig14,15. Im Vergleich zu kulturbasierten Methoden sind der Nachweis und die Serotypisierung auf der Basis der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nicht auf die Lebensfähigkeit des Organismus angewiesen, die durch Antibiotikaeinsatz, Probentransport und Lagerbedingungen negativ beeinflusst werden kann, sind weniger zeitaufwändig, ermöglichen eine schnellere Diagnose und eine höhere Empfindlichkeit15 . Konventionelle und Echtzeit-PCR wurden verwendet, einschließlich verschachtelter Einzelröhrchen- und Multiplex-PCRs mit Gel- oder Kapillarelektrophorese und kombiniert mit Dot-Blot-Detektion, Kulturanreicherung und sequenzbasierter Analyse16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. Es wurden Echtzeit-PCR-Methoden entwickelt, mit denen immer mehr Serotypen nachgewiesen wurden21,29,30,31, auch in Hochdurchsatzsystemen15,32,33. Darüber hinaus sind quantitative PCR-Methoden (qPCR), die zur Bestimmung der Bakterienlast validiert sind29,31,32,34, wichtig für die Bewertung der Auswirkungen von Impfstoffen in öffentlichen Gesundheitsprogrammen. Eine erhöhte Bakterienlast im Nasopharynx kann ein serotypspezifisches invasives Krankheitspotenzial vorhersagen31.

Zuvor haben wir ein nanofluidisches qPCR-Reaktionsset entwickelt, mit dem 55 Pneumokokken-Serotypen32 gleichzeitig nachgewiesen und quantifiziert werden konnten, sowie eine Nachweis- und Typisierungsmethode zur Unterscheidung der Serogruppen 6A/B/C/D, 18A/B/C und 22A/F in einzelne Serotypen35 unter Verwendung derselben Plattform. Hier erweitern wir unsere Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung weiterer 38 Serotypen – was eine umfassende Pneumokokken-Serotypisierung (92 Serotypen) und den Nachweis von 15 weiteren Bakterienarten ermöglicht, um die Besiedlung und Bakterienbelastung in Atemwegsproben zu beurteilen.

Um einen umfassenden Reaktionssatz für die Serotypisierung von S. pneumoniae und den Nachweis anderer möglicherweise im Nasopharynx vorkommender Spezies innerhalb einer hauseigenen, nanofluidischen Hochdurchsatz-Echtzeit-PCR-Plattform zu entwickeln, wurde eine Überprüfung des veröffentlichten Assaysatzes ( Primer- und Sondensequenzen wurden durchgeführt. Repräsentative GenBank-FASTA-Sequenzen für die Kapselgene der Serotypen 19B (CR931676) und 19F (CR931678), das mutmaßliche Pneumokokken-Xisco-Protein-Gen (NC_003028) und das Haemophilus influenzae Bex-Einkapselungsgen (X54987) wurden in BioEdit unter Verwendung von ClustalW Multiple Alignment ausgerichtet36,37. Standardprimer und farbstoffmarkierte MGB-Sonden wurden manuell entwickelt, um das 19F-Kapselpolysaccharid-Gen wzh nachzuweisen, um 19F von 19B1,2 zu unterscheiden, um das Pneumokokken-Xisco-Gen nachzuweisen und um das H. influenzae-BexA-Gen nachzuweisen. Alle kuratierten Oligonukleotidsequenzen für jeden in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführten Assay-Satz wurden analysiert, um die Spezifität in silico mithilfe des Basic Local Alignment Search Tool (NCBI BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) sicherzustellen. vor der Aufnahme in den Reaktionssatz. Die Schmelztemperatur (Tm) einzelner Oligonukleotide in jedem Assay-Set wurde zur Beurteilung mithilfe der Online-Tools Oligocalc38 und des Integrated DNA Technologies (IDT) OligoAnalyzer (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) bestimmt ihre Eignung für die Einbindung in ein einheitliches thermisches Profil und Multiplexing. Das IDT OligoAnalyzer-Tool wurde zur Bewertung von Sekundärstrukturen und Selbstbindungsstellen verwendet. Die analytische Wirksamkeit (Effizienz, Sensitivität und Spezifität) und diagnostische Leistung (Sensitivität, Spezifität und Konkordanz) des verketteten Reaktionssatzes innerhalb der nanofluidischen Hochdurchsatz-Echtzeit-qPCR („Fluidigm“, Standard BioTools) wurde durch Kalibratoren ermittelt bzw. klinische Proben.

Kontrollstämme wurden nach Standardmethoden für Mikrotiterkulturen gezüchtet, um ihre relative Dichte als koloniebildende Einheiten (KBE/ml) zur Verwendung als Quantifizierungskalibratoren und zur Beurteilung der analytischen Wirksamkeit zu quantifizieren. Die gesamte DNA wurde extrahiert und bis zum Test wie zuvor beschrieben bei –30 ° C gelagert. DNA von 89 Isolaten, die repräsentativ für die enthaltenen Pneumokokken-Serotypen und 15 anderen Bakterien waren, wurde verwendet, um die PCR-Assay-Sets zu optimieren und die analytische Spezifität der Assay-Sets für ihre jeweiligen Ziele zu bewerten (Pneumokokken-Serotypen: 1; 2; 3; 4). ; 5; 6A; 6B; 6C; 6D; 7A; 7B; 7F; 7C; 8; 9A; 9L; 9N; 9V; 10A; 10B; 10C; 11A; 11B; 11C; 11D; 11F; 12B; 12F; 13 ; 14; 15A; 15B; 15C; 15F; 16A; 16F; 17A; 17F; 18A; 18B; 18C; 18F; 19A; 19B; 19C; 19F; 20; 21; 22A; 22F; 23A; 23B; 23F; 24 A ; 24B; 24F; 25A; 25F; 27; 28A; 28F; 29; 31; 32A; 32F; 33A; 33B; 33C; 33D; 33F; 34; 35A; 35C; 35F; 35B; 36; 37; 38; 39 ; 40; 41A; 42; 43; 44; 45; 46; 47A; 47F; 48; Acinetobacter baumannii, Bordetella holmesii, B. parapertussis, B. pertussis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae-b, nicht typisierbarer Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus algalactiae und Streptococcus pyogenes). Die Kontrollisolate wurden vom National Institute for Communicable Diseases (NICD), Südafrika, dem Murdoch Children's Research Institute (MCRI), Australien, und der South African Medical Research Council Vaccines and Infectious Diseases Analytics Research Unit (Wits-VIDA), Soweto, bezogen , Südafrika.

Wir verwendeten synthetische doppelsträngige DNA (dsDNA)-Matrizengenfragmente (gBlocks) als externe Kalibratoren (Ergänzungstabellen S2 und S3) für die analytische Wirksamkeit und die Variation innerhalb und zwischen den Tests. Die gBlocks enthielten Sequenzen für jeden Pneumokokken-Serotyp oder jedes andere bakterielle Ziel gemäß dem Pool (Ergänzungstabelle S4), in dem die jeweiligen Assay-Sets enthalten waren. Diese wurden angewendet, um die analytische Sensitivität (Nachweisgrenze) und Wiederholbarkeit (Intra- und Inter-Assay-Variation und Levy-Jennings-Diagramme) des Reaktionssatzes zu bewerten. Das Design, die Eigenschaften und die Sequenzen jedes gBlocks wurden zuvor detailliert beschrieben35. Kurz gesagt, für jeden der drei Pools (A, B und C, Ergänzungstabelle S4) wurden drei gBlocks entworfen (insgesamt neun), die jeweils neun bis dreizehn Zielregionen umfassten. Zielsequenzen innerhalb von gBlocks lassen sich leicht quantifizieren, da ein äquimolares Verhältnis aller Templates vorliegt. Die Menge an synthetischer gBlock-DNA wurde mit dem Thermo Fisher Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer Qubit 2.0 mit dem Invitrogen Qubit dsDNA BR Assay Kit gemessen. Die Kopienzahl bzw. die Anzahl der Genäquivalente wurde nach folgender Formel berechnet:

Die Menge war der Durchschnitt der drei Qubit-Messungen, der mit der Avogadro-Zahl (6,022 × 1023) multipliziert wurde. Die Länge in Basenpaaren wurde mit dem durchschnittlichen Gewicht eines dsDNA-Nukleotids (660 Dalton oder g/Mol) multipliziert und zurück in ng (1 × 109) umgerechnet.

Von Mai bis Oktober 2009 und von Mai 2010 bis Februar 2011 wurden in Agincourt, Mpumalanga, und Soweto, Gauteng, jeweils zwei Beförderungsuntersuchungen durchgeführt, um die serotypspezifische Pneumokokkenbesiedelung während der frühen Phase der Einführung von PCV7 in Südafrika, die im Mai begann, zu bewerten 200939,40. Beförderungsisolate aus diesen Querschnittsuntersuchungen wurden zuvor mit mikrobiologischen Standardmethoden kultiviert und mit der Quellung-Methode serotypisiert. Hier haben wir alle verfügbaren archivierten Nasopharynxabstriche (NPS) von Kindern im Alter von 0 bis 5 Jahren einbezogen, um unsere Methode zur Pneumokokken-Serotypisierung in den Altersgruppen zu bewerten, in denen die Pneumokokkenbesiedlung am höchsten war (Abb. 1). Rückblickend wurden alle archivierten Proben, unabhängig von den Kulturergebnissen, erneut mit „Fluidigm“ getestet, es sei denn, die Proben waren erschöpft oder es lagen keine Quellung-Ergebnisse vor, um den Reaktionssatz für eine genaue Serotypisierung in klinischen Proben zu validieren, wie in Abb. 1 dargestellt. Von den 1973 archivierten klinischen Proben, die für die aktuelle Analyse verfügbar waren, waren 69,2 % kulturell positiv auf Pneumokokken.

Validierungsflussdiagramm, das die enthaltenen archivierten klinischen Proben beschreibt, die zuvor mit der kulturbasierten Quellung-Methode serotypisiert und mit der quantitativen Echtzeit- und Serotypisierungs-PCR „Fluidigm“ von Standard BioTools verglichen wurden. A09C bezeichnet Proben, die von Kindern aus Agincourt (2009) entnommen wurden39. S10C weist auf Proben von Kindern aus Soweto (2010/11)40 hin. Bei den Proben handelte es sich um in STGG archivierte Nasopharyngealabstriche, wie im Abschnitt „Klinische Proben (Nasopharyngealabstriche) zur Validierung“ beschrieben, die zuvor mit der kulturbasierten Quellung-Methode getestet wurden39,40. Archivierte klinische Proben wurden verwendet, um die diagnostische Leistung des „Fluidigm“ qPCR zu bewerten. Wenn Proben als fehlend/erschöpft angegeben wurden, standen diese Proben nicht für die Nukleinsäureextraktion zur Verfügung, da sie entweder durch frühere Tests erschöpft waren oder das Probenfläschchen nicht gefunden wurde. Wenn die Proben als fehlgeschlagen/erschöpft angegeben sind, ist die Nukleinsäureextraktion fehlgeschlagen und es war nicht genügend Probe übrig, um diese Extraktion zu wiederholen. Bei den Kontrollproben handelte es sich um Kulturstämme, die zur Beurteilung der analytischen Leistung des „Fluidigm“-qPCR verwendet wurden. Sie werden im Abschnitt „Methoden zur Gesamtnukleinsäureextraktion“ beschrieben. Alle extrahierten Proben und Kontrollen wurden im „Fluidigm“ getestet, jedoch wurden nur Proben mit einem Quellung-Ergebnis (positiv oder negativ) in den Vergleich der diagnostischen Leistung einbezogen.

Proben (NPS in Magermilch-Trypton-Glucose-Glycerin-Transportmedien [STGG]), die bei –80 °C gelagert wurden, wurden aufgetaut und 30 s lang bei niedriger Geschwindigkeit verwirbelt. Nukleinsäuren wurden aus 400 µl STGG extrahiert und unter Verwendung der automatisierten Nukleinsäureextraktionsplattform BioMérieux NucliSens easyMAG (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) gemäß den Standardprotokollen des Herstellers in 100 µl Elutionspuffer eluiert. Eine No-Template-Kontrolle (NTC), bei der es sich um leeres STGG handelte, war in jeder Charge von 23 extrahierten klinischen Proben enthalten. Nukleinsäuren wurden bis zur Untersuchung bei –30 °C gelagert.

Die spezifische Zielamplifikation (STA) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers als erster Schritt (Voramplifikation der DNA) für das Biomark HD-System (Standard BioTools, ehemals Fluidigm) durchgeführt, wie zuvor beschrieben35. Kurz gesagt, die Assay-Sets (nur Primer) wurden in drei STA-Multiplex-Pools aufgeteilt (Ergänzungstabelle S3), um eine Kreuzreaktivität der Primer zu verhindern. Nach der STA wurde die qPCR entweder mit dem integrierten Fluidschaltkreis (IFC) Standard BioTools 96.96 Gene Expression (GE) Dynamic Array (Produktnummer BMK-M-96.96) oder dem Flex Six 12.12 GE IFC (Produktnummer 100-6308) durchgeführt ein Reaktionsset, das 96 Proben mit 96 Assay-Sets für 9.216 einzelne qPCR-Reaktionen pro Array bzw. 12 Proben mit 12 Assay-Sets für 144 Reaktionen pro Array kombiniert. Ein Flussdiagramm der Vorbereitung und des Ladens der Standard BioTools („Fluidigm“) 96.96 IFC ist in der ergänzenden Abbildung S1 detailliert beschrieben und wurde bereits ausführlich beschrieben35. Kurz gesagt, für jede Probe wurde das STA-Produkt aus jedem der drei Pools (5 µL) und 10 µL H2O in Molekularqualität kombiniert, um alle verbleibenden Primer zu verdünnen. Anschließend wurde die Assay-Vormischung für jedes Ziel in die IFC-Assay-Einlässe gesaugt, um eine Endkonzentration von 9 µM Primern und 2,5 µM Sonde pro Reaktion und Proben zu erreichen (2,25 µL gepooltes STA-Produkt, 2,50 µL Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Master Mix, Katalognummer 4370074). und 0,25 µL Standard-BioTools/Fluidigm-Probenladereagenz) wurden in die Probeneinlässe angesaugt. Die IFC wurde dann im BiomarkHD-Thermocycler unter den vom Hersteller angegebenen Temperaturwechselbedingungen durchgeführt: 50 °C für 2 Minuten, 70 °C für 30 Minuten, 25 °C für 10 Minuten, 50 °C für 2 Minuten, 96,5 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 96 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 60 Sekunden. Die Ergebnisse wurden mit der Software Fluidigm Real-time PCR Analysis analysiert. Hier wurden Schwellenwerte manuell definiert; Die Basislinie wurde automatisch zugewiesen und ein Quantifizierungszyklus-Grenzwert (Cq) von 38 angewendet.

Regressionskalibrierungskurven (Standardkurven) wurden für jeden Assay-Satz unter Verwendung von doppelten zehnfachen Reihenverdünnungen der angestrebten positiven Kontrollstämme oder gBlocks erstellt. Die Standardkurven umfassten fünf Datenpunkte; Ausreißer am Ende des Bereichs, die keine Werte des linearen Quantifizierungszyklus (Cq) enthielten, wurden entfernt, um den Wert des linearen dynamischen Bereichs und des Bestimmungskoeffizienten (r2) zu definieren. Bei einer hohen Template-Konzentration liegen PCR-Inhibitoren in einer höheren Konzentration vor, wohingegen in stark verdünnten Proben die stochastische Bindung zu einer Variabilität der Amplifikation führt. Konzentrierte oder verdünnte Template oder Verdünnungsfehler beeinträchtigen daher die Amplifikationseffizienz und führen zu unvorhersehbaren Cq-Werten. Werte, die außerhalb der Linearitätsgrenze liegen, werden durch die lineare Gleichung nicht mehr vorhergesagt. Aus diesem Grund werden Ausreißer ausgeschlossen. Die Effizienz (%) für jedes eingeschlossene Assay-Set wurde aus der Steigung (m) der linearen Gleichung (y = mx + c) abgeleitet, die aus den Standardkurven unter Verwendung der Gleichung generiert wurde:

Eine dreifache Verdünnungsreihe von Bakterienkontrollstämmen oder gBlocks am unteren Ende des linearen dynamischen Bereichs (103–100 Kopien pro µL) wurde verwendet, um die analytische Empfindlichkeit oder Nachweisgrenze (LOD) zu bestimmen, die als niedrigste KBE/ml oder Kopien definiert ist in dreifacher Ausfertigung von „Fluidigm“ qPCR nachgewiesen. Es wurde eine DNA-Bibliothek der Ziel-Pneumokokken-Serotypen oder anderer Bakterienarten mit durchschnittlich 103–104 KBE/ml erstellt. Die analytische Spezifität wurde bewertet, indem die DNA-Bibliothek mit jedem Assay-Set im „Fluidigm“-qPCR verglichen wurde.

Für Assay-Sets, die innerhalb der vorgeschriebenen Effizienzbereiche (90–110 %) lagen, wurde die relative Quantifizierung der Bakteriendichte mithilfe der linearen Gleichung extrapoliert, die aus den Standardkurven der Kalibratoren (Kontrollstämme und gBlocks bekannter Dichte) mithilfe der Gleichung generiert wurde :

Wenn mehr als ein Assay-Set einen Serotyp nachweist oder bestimmt, wurde die durchschnittliche Dichte berechnet. Um beispielsweise die Dichte des Serotyps 6A zu berechnen:

Die relative Dichte zwischen Serotypen wurde verwendet, um eine Hierarchie bei der gleichzeitigen Übertragung mehrerer Serotypen festzulegen, wobei primäre Serotypen diejenigen mit der höchsten Dichte und subdominante oder kokolonisierende Serotypen diejenigen mit niedrigerer relativer Dichte waren. Bland-Altman-Diagramme (Differenz vs. Mittel) wurden erstellt, um die Dichte von LytA mit PiaB und die durchschnittliche Pneumokokkendichte (LytA und PiaB) mit der Summe der Serotypendichte pro Probe zu vergleichen.

Die diagnostische Sensitivität wurde durch eine verblindete erneute Analyse der gelagerten klinischen Proben (n = 1973; Abb. 1) bewertet, die zuvor mit der Quellung-Methode kultiviert und serotypisiert wurden. Die Proben wurden erneut mit dem qPCR-Reaktionssatz innerhalb der 96,96 IFC getestet, der die extrahierten NTC- und Quantifizierungskalibratoren (in den Tabellen 2 und 3 aufgeführte gBlocks oder Kontrollstämme mit 104 und 103 KBE/ml) enthielt. Der McNemar-Test wurde verwendet, um den Serotypnachweis im qPCR-Reaktionssatz mit dem der Quellung-Methode zu vergleichen. Um einem positiven Serotyp zugeordnet zu werden, mussten die Proben positiv für beide Pneumokokken-Referenzgene LytA und PiaB sein. Wenn diese Pneumokokken-Gene nicht nachgewiesen wurden, aber ein serotypspezifischer Testsatz positiv war, wurde kein Serotyp zugeordnet. Die Serotypbezeichnung durch „Fluidigm“ qPCR und Quellung wurde als unterschiedlich angesehen, wenn die p-Werte ≤ 0,05 waren. Der Kappa-Koeffizient von Cohen wurde verwendet, um die serotypspezifische Übereinstimmung von „Fluidigm“ qPCR und Quellung pro klinischer Probe zu bestimmen. Kappa-Werte von < 0,20, 0,21–0,40, 0,41–0,60, 0,61–0,80 und 0,81–1,00 wurden als schlechte, mittelmäßige, mäßige, gute bzw. ausgezeichnete Übereinstimmung angesehen. Die Analysen wurden in Stata Version 13.0 durchgeführt, einschließlich der Anwendung relevanter Algorithmen für die Serotypzuordnung.

Die Wiederholbarkeit (Intra-Assay-Varianz) wurde anhand der Standardabweichung (SD) für die Cq-Varianz von gBlocks bestimmt, die innerhalb derselben IFC bei 103 Genäquivalenten dreifach ausgeführt wurden. Die Reproduzierbarkeit (Inter-Assay-Varianz) wurde als Standardabweichung für die Cq-Varianz für die gBlocks zwischen vier verschiedenen IFCs definiert.

Für die erste Probenentnahme wurde vom Medical Human Research Ethics Committee (HREC) der University of Witwatersrand eine ethische Genehmigung eingeholt (Soweto-Kohorte HREC: M090115; Agincourt-Kohorte HREC: M090114). Im Rahmen der ursprünglichen Studie, in der Proben entnommen wurden, wurde von allen Erziehungsberechtigten der Teilnehmer eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Molekulare Methoden und die Verwendung von Proben in dieser Analyse wurden vom HREC der University of Witwatersrand genehmigt (HREC: M170314). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten lokalen und internationalen Richtlinien und Vorschriften für gute klinische Praxis durchgeführt.

Insgesamt waren 96 Assay-Sets im endgültigen „Fluidigm“-qPCR-Reaktionsset enthalten. Mit der qPCR konnten 92 Pneumokokken-Serotypen nachgewiesen und diese in 35 Serotypen in 16 Gruppen und 57 Einzeltypen differenziert sowie 15 weitere Bakterienarten identifiziert werden (Abb. 2, Ergänzungstabelle S4).

Zusammenfassendes Netz der 92 Pneumokokken-Serotypen (57 einzelne Serotypen und 35 Serotypen innerhalb von 16 Serogruppen), die vom „Fluidigm“-Reaktionsset erkannt wurden. Grau hervorgehoben sind die PCV7-Serotypen: 4, 6B, 9A/V, 14, 18C, 19F und 23F; PCV10-Serotypen: PCV7-Serotypen und 1, 5, 7A/F; PCV13-Serotypen: PCV10-Serotypen und 3,6A und 19A. NVT: Serotypen, die nicht in PCV13 enthalten sind.

Die Amplifikationseffizienz im gesamten Reaktionssatz war für 91 Testsätze ausgezeichnet und lag im vorgeschriebenen Bereich von 90–110 % (Tabelle 1). Für diese Assay-Sets wurden die Datenpunkte durch die lineare Gleichung der Regressionskurven (r2 > 0,98, Tabelle 1) genau vorhergesagt, was eine relative Quantifizierung der Bakterienlast mithilfe der Steigung der linearen Gleichung ermöglichte. Der lineare dynamische Bereich für diese Assay-Sets betrug mindestens das 5-Log-fache. Darüber hinaus lagen Levy-Jennings-Diagramme, die mit Assay-Set-spezifischen Referenzkalibratoren erstellt wurden, innerhalb von ± 2,0 SD vom mittleren Cq-Wert aller Platten. Dies bestätigte die Verwendung der entwickelten Kalibratoren (gBlocks). Die Assay-Sets zum Nachweis von E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, dem Xisco-Gen von S. pneumoniae und dem bakteriellen 16S-ribosomalen RNA-Gen (aufgelistet in der Ergänzungstabelle S1) zeigten in diesem Reaktionsset keine gute Leistung. da der Wirkungsgrad < 90 % oder > 110 % oder r2 < 0,98 war (Ergänzungstabelle S5).

Die analytische Sensitivität war für 91 enthaltene Assay-Sets hoch (LOD: 10–100 Genäquivalente, Tabelle 1). Die Assay-Sets erbrachten eine konsistente Leistung, wobei die Cq-Werte der Replikate (n = 3) gleichzeitig innerhalb einer Reaktionsplatte (Intra-Assay) oder in aufeinanderfolgenden Reaktionsplatten (Inter-Assay) innerhalb von ± 0,1 SD des Mittelwerts amplifiziert wurden. Von den 96 Assay-Sets innerhalb der „Fluidigm“-qPCR waren 94 Assay-Sets spezifisch für ihre Zielkalibratoren zur Bakterienkontrolle, und es wurde keine Kreuzreaktivität zwischen den Assay-Sets beobachtet. Zwei Reaktionssätze, nämlich 10A und 33B, erkannten andere Serotypen innerhalb derselben Gruppe, nämlich 10B bzw. 33C. Diese Assay-Sets wurden daher entsprechend umbenannt – 10A wurde in 10A/B umbenannt und 33B wurde in 33B/C umbenannt. Ein Serotypisierungsalgorithmus, der auf dem Erkennungsmuster aller Assay-Sets gegen alle Zielbakterienstämme basiert, wurde angewendet, um einige einzelne Serotypen zu analysieren, nämlich: 6A, 6B, 6C, 6D, 10A, 11E, 12A/F/44, 18A, 18B, 18C, 18F, 19B, 22A, 23A, 38, 37, 33AF, 35F, 47A, 47F, nicht typisierbares S. pneumoniae, nicht typisierbares H. influenzae, nicht typisierbares H. influenzae, B. pertussis, B . holmesii und B. parapertussis (Tabelle 2). Assay-Sets für die Serotypen 10B und 33C waren im Reaktions-Set enthalten und daher wurde die Spezifität der Serotyp-Zuordnung durch den Algorithmus nicht durch kreuzreagierende Serotypen beeinträchtigt, da 10A und 33B von diesen jeweiligen Assay-Sets nicht erkannt wurden. Beispielsweise würde der Serotyp 10A vom Assay-Set 10A und nicht vom Assay-Set 10B erkannt werden und daher dem Serotyp 10A zugeordnet werden; wohingegen Serotyp 10B durch Assay-Set 10A und Assay-Set 10B erkannt würde und daher dem Serotyp 10B zugeordnet würde.

Da die diagnostische Leistung mit der Quellung-Methode verglichen wurde, wurde diese nur auf Pneumokokken-Serotypen angewendet. Darüber hinaus konnte die diagnostische Leistung des „Fluidigm“ nicht für Assay-Sets beurteilt werden, die auf Bakterienarten oder Pneumokokken-Serotypen abzielten, die zuvor nicht in archivierten klinischen Proben mithilfe kulturbasierter Methoden nachgewiesen wurden (aufgeführt in der Fußnote von Tabelle 3). Die „Fluidigm“-qPCR-Methode war in der Lage, Pneumokokken-Serotypen im Vergleich zum Referenzstandard (Quelle) korrekt zu klassifizieren, und die Fläche unter der Kurve (ROC-AUC) der Empfänger-Operator-Kurve war für alle verglichenen Assay-Sets größer als 0,73 (Tabelle 3). „Fluidigm“ qPCR identifizierte Ziele mit einer Sensitivität von > 80 % (Tabelle 3) in den 1.973 archivierten klinischen Proben für 36 Assay-Sets. Die diagnostische Sensitivität für sechs Assay-Sets (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B und 35A/C/42) war geringer (50–74 %, Tabelle 3) als die Prävalenz der durch Quellung nachgewiesenen Zielserotypen betrug ≤ 1 %, wohingegen mit „Fluidigm“ qPCR zusätzliche gezielte Serotypen nachgewiesen wurden (Abb. 3). Die übrigen Testsätze konnten nicht wie oben erläutert bewertet werden. Die diagnostische Spezifität war hoch (> 95 %) für alle Assay-Sets, bei denen Zielserotypen zuvor durch Quellung nachgewiesen wurden (Tabelle 3).

Prävalenz einzelner Streptococcus pneumoniae-Serotypen, die mit dem qPCR-Reaktionsset „Fluidigm“ nachgewiesen wurden, im Vergleich zur kulturbasierten Quellung-Methode. Serotypen, die in Proben sowohl mit „Fluidigm“ als auch mit Quellung nachgewiesen wurden, werden als konkordant klassifiziert, während Proben, die nur mit einer Methode nachgewiesen wurden, als zusätzliche Serotypen klassifiziert werden.

Es gab eine gute Übereinstimmung zwischen Kultur und „Fluidigm“-qPCR, wobei die meisten Assay-Sets mit beiden Methoden denselben Serotyp nachweisten (Kappa 0,61–0,8), mit Ausnahme der Serotypen/Gruppen 1, 5 und 23A, die eine gute Übereinstimmung aufwiesen (Kappa 0,41–0,60) und die Serotypen 7A/F, 11B/C, 12A/F/44, 33A/F, 35A/C/42, 35F und 38, die eine mäßige Konkordanz aufwiesen (Kappa 0,21–0,40). Wenn die Übereinstimmung als mittelmäßig oder mäßig bewertet wurde, war dies auf den Nachweis dieser Serotypen in zusätzlichen Proben durch „Fluidigm“ qPCR im Vergleich zu Quellung (Serotypen 5; 23A; 12A/F/44; 35A/C/42 und 38) zurückzuführen. und außerdem, wenn mit der Quellung-Methode insgesamt weniger als fünf Proben nachgewiesen wurden (Serotypen 1; 7A/F; 11B/C; 33A/F und 35F) (Abb. 3). Für einen Testsatz (Serotyp 29) wurde die Konkordanz als schlecht bewertet (κ < 0,20). Für dieses Ziel erkannte „Fluidigm“ qPCR eine von zwei Proben, die mit der kulturbasierten Quellung-Methode als 29 serotypisiert wurden. Weitere acht Proben, die mit Quellung negativ waren, wurden jedoch mit „Fluidigm“ qPCR als 29 serotypisiert. „Fluidigm“ qPCR war im Vergleich zur Kultur empfindlicher beim Nachweis aller entsprechenden Serotypen/Gruppen (McNemar-Test: p < 0,05; Tabelle 3), mit Ausnahme der Serotypen 6C, 7A/F, 7B/C/40, 9L/N, 10A, 11B /C, 15B/C, 18C, 20, 21, 22F, 23B, 25A/F und 33B, wobei kein Unterschied in der Klassifizierung zwischen den beiden Methoden festgestellt wurde (McNemar-Test: p > 0,05; Tabelle 3). Mit dem „Fluidigm“-Reaktionssatz konnten 39,1 % (826/2113) zusätzliche Serotypen identifiziert werden, die über die in der Kultur nachgewiesenen Serotypen für die verglichenen Testsätze in Tabelle 3 hinausgingen, und im Gegenzug wurden in der Kultur 132 (9,3 % von 1419) nicht identifizierte Serotypen nachgewiesen durch 'Fluidigm' qPCR (Tabelle 3, Abb. 3).

Die GMD (geometrische mittlere Dichte) für alle Serotypen und bakteriellen Ziele ist in der Ergänzungstabelle S6 dargestellt und in der Ergänzungsabbildung S2 zusammengefasst. Die Hierarchie der kokolonisierenden Pneumokokken-Serotypen ist in der Ergänzungstabelle S7 dargestellt. Von den zusätzlichen Serotypen, die durch „Fluidigm“ qPCR nachgewiesen wurden, waren 72,6 % (831/1 144) kokolonisierende Serotypen oder Serotypen mit geringerer Dichte im Vergleich zum primären Serotyp oder Serotyp mit der höchsten Dichte. Der GMD der durch „Fluidigm“ qPCR nachgewiesenen zusätzlichen Serotypen war niedriger als dort, wo die Serotypbezeichnung zwischen „Fluidigm“ qPCR und Quellung übereinstimmte [2,3 (95 %-Konfidenzintervall/KI: 2,2–2,4) und 4,1 (95 %-KI: 4,0). –4,2); Abb. 4].

Die geometrische mittlere Dichte (GMD), ausgedrückt als Log10-Genäquivalente (GE)/ml, bestimmt durch „Fluidigm“ qPCR. Konkordante Serotypen (blau) wurden sowohl mit der auf der Referenzkultur basierenden Quellung-Methode als auch mit „Fluidigm“ nachgewiesen. Zusätzliche Serotypen sind diejenigen, die nur durch „Fluidigm“ qPCR nachgewiesen wurden (rot).

Es gab eine hervorragende Übereinstimmung zwischen der Pneumokokkendichte, die aus den LytA- und PiaB-Testsätzen berechnet wurde (Verzerrungslinie: – 0,2), wenn man sie mit Bland-Altman-Diagrammen vergleicht (ergänzende Abbildung S3A). Darüber hinaus lagen nur 6,9 % (58/836) der Datenpunkte außerhalb des engen 95 %-KI (−1,7 bis 1,3). Die Übereinstimmung zwischen der durchschnittlichen Pneumokokkendichte (LytA und PiaB) und der Summe aller Serotypdichten (alle serotypspezifischen Assay-Sets) war mit 5,8 % (45/776) akzeptabel (Verzerrungslinie: − 1,2, ergänzende Abbildung S3B). der Daten außerhalb des 95 %-KI (− 6,7 bis 4,0). In 7,8 % (65/836) der Pneumokokken-positiven Proben wurden keine Serotypen nachgewiesen, und in weiteren 3,6 % (30/836) lag der Unterschied zwischen der Pneumokokkendichte und der Gesamtserotypendichte über dem oberen KI-Wert des Bland– Altman-Handlung.

Wir haben ein nanofluidisches qPCR-Reaktionsset entwickelt und validiert, das empfindlich, spezifisch und reproduzierbar ist und den genauen Nachweis und die Quantifizierung von 92 Pneumokokken-Serotypen und anderen kolonisierenden Bakterien in 96 Proben (einschließlich Kalibratoren) pro Reaktionsplatte ermöglicht. Die Leistung der hier beschriebenen Assay-Sets ist vergleichbar mit anderen Reaktions-Reaktions-Sets mit hohem Durchsatz zum Nachweis des Pneumokokkentransports, einschließlich der Standard-BioTools-Plattform „Fluidigm“32,33 und der TaqMan-Array-Karten15 für LOD (< 103 KBE/ml). ; Effizienz (90–110 %); linearer Dynamikbereich (fünffach) und Linearität (R2 > 0,98). Bemerkenswert ist, dass der Nachweis zusätzlicher Serotypen (39,1 %) durch das hier beschriebene qPCR-Panel „Fluidigm“ mit 96 Assay-Sets mit dem zuvor beschriebenen „Fluidigm“-Panel (ebenfalls 39,1 %) vergleichbar ist, das 48 Assay-Sets umfasste32. Verglichen mit der auf Goldstandards basierenden Quellung-Methode war unser Reaktionssatz für die Klassifizierung von Pneumokokken-Serotypen zu 98,8 % genau. Darüber hinaus betrug die durchschnittliche Sensitivität im gesamten qPCR-Reaktionssatz 89,1 % im Vergleich zu Quellung.

Frühere molekulare Serotypisierungstechniken haben häufige Serotypen entdeckt; Andere neu auftretende oder ungewöhnliche NVT wurden jedoch nicht festgestellt. Die Erweiterung des Spektrums an Serotypen, die mit Methoden mit höherem Durchsatz nachweisbar sind, wird immer wichtiger, da NVT VT im Transport ersetzt41,42,43. Es ist auch wichtig, die Bakterienlast oder -dichte direkt aus klinischen Proben ohne einen dazwischenliegenden Kulturschritt zu erkennen und dem Träger mehrerer Serotypen (Kokolonisierung) zuzuordnen, was einen Vorteil molekularer Techniken gegenüber standardmäßigen kulturbasierten Methoden darstellt44. Zuvor wurde die unvollständige Serotypisierung als Nachteil der molekularen Serotypisierung in unserem Umfeld (Südafrika) beschrieben, wo sich die Serotyp-Prävalenz von der in anderen geografischen Regionen unterscheidet45,46. Nach unserem besten Wissen handelt es sich bei der hier beschriebenen „Fluidigm“-qPCR-Methode um den umfassendsten Reaktionssatz für die quantitative molekulare Serotypisierung mit hohem Durchsatz, der bisher entwickelt wurde.

Bemerkenswert ist, dass Pai et al.25,26 eine konventionelle Multiplex-PCR-Methode entwickelten, um 29 häufige Serogruppen/Typen zu bestimmen, die nacheinander auf 40 einzelne Serotypen eingegrenzt wurden. Azzari et al.21 verwendeten Echtzeit-PCR zum Nachweis von 21 Serotypen. Sakai et al.29 entwickelten dann 27 neue Assay-Sets zum Nachweis von 72 Serotypen/Gruppen. Pholwat et al.15 optimierten eine PCR-basierte mikrofluidische TaqMan-Array-Karte (TAC), die 74 Serotypen in bis zu sieben klinischen Proben pro Karte abdeckt. Sakai et al.30 entwickelten einen qPCR-Reaktionssatz weiter, um 46 einzelne Serotypen und 33 Serotypen innerhalb von 20 Serogruppen nachzuweisen. Im „Fluidigm“ verwendeten Dhoubhadel et al.33 die SYBR-Green-Chemie zum Nachweis von 50 Serotypen (16 einzelne Serotypen und 13 Untergruppen). Messoudi et al.31 passten die Assay-Sets von Pai et al.26 in eine sequentielle Echtzeit-Multiplex-PCR an, um 40 Serotypen oder Gruppen mithilfe von Locked Nucleic Acid (LNA)-modifizierten Sonden nachzuweisen. Zusammen haben diese Studien die Entwicklung der molekularen Serotypisierung vorangetrieben und nützliche Assay-Sets für die Verwendung in unserer „Fluidigm“-qPCR bereitgestellt, die wir in Multiplex-STA-Pools weiter optimiert haben, um 92 Pneumokokken-Serotypen nachzuweisen und zu quantifizieren, wobei 16 Serogruppen und 57 einzelne Serotypen unterschieden werden. Vor unserer Studie wurden modifizierte Sonden nicht in einem Hochdurchsatzsystem wie mikro- oder nanofluidischen PCR-Systemen verwendet oder in der „Fluidigm“-Plattform von Standard BioTools empfohlen. Unsere Studie hat gezeigt, dass diese modifizierten Sondenstrategien bei der nanofluidischen qPCR „Fluidigm“ mit hohem Durchsatz gut funktionieren.

Aufgrund des ätiologischen Zusammenhangs zwischen hoher Bakterienlast, Übertragungsrisiko und dem invasiven Potenzial von Serotypen ist die Quantifizierung der Bakterienlast in Transportstudien wichtig, um die Auswirkungen von Impfstoffen zu beurteilen. Abgesehen von den Serotypen 12F, 8, 24F, 33F, 38 und 10A wurde gezeigt, dass NVT, die am Austausch von Transportserotypen beteiligt sind, gemäß Fall-zu-Träger-Verhältnisanalysen ein geringes invasives Potenzial haben47,48; Allerdings haben molekulare Studien gezeigt, dass eine hohe Bakteriendichte das invasive Potenzial dieser kolonisierenden Serotypen vorhersagen kann. Von den zusätzlichen Serotypen, die in PCV15 (22F, 33F) und PCV20 (8, 10A, 11A, 12F und 15BC) enthalten sind, identifizierte „Fluidigm“ qPCR weitere 0,3 % des Serotyps 8; 0,4 % von 10 A; 1,0 % von 11A/D; 0,7 % von 12A/F/44; 0,9 % von 15B/C und 0,6 % von 33A/F im Vergleich zur Kultur. Eine molekulare Studie (an mehreren Standorten: Südafrika, Brasilien, Mali, Kambodscha und Frankreich), in der die nasopharyngeale Bakterienlast invasiver Isolate mit asymptomatischen Trägerisolaten für synonyme Serotypen verglichen wurde, ergab eine fünffach höhere mittlere Bakterienlast bei invasiven Isolaten (263,4 × 105 KBE). /ml; ± 57,07 × 105 vs. 49,9 × 105 KBE/ml ± 67,4 × 105)31.

Die bakterielle Prävalenz kann auch eng mit der Bakterienbelastung verbunden sein, die das Risiko einer Weiterübertragung erhöht. Beispielsweise wurden die serotypspezifische Bakterienlast und -prävalenz in einer vietnamesischen Studie verglichen, an der Kinder unter 5 Jahren, die mit einer akuten Atemwegsinfektion (ARI) ins Krankenhaus eingeliefert wurden, und gesunde Kinder gleichen Alters einbezogen wurden. Hier war eine hohe Bakterienlast pro Serotyp mit einer höheren Prävalenz sowohl bei ARI-Fällen (Spearmans ρ = 0,44, n = 186; p < 0,0001) als auch bei gesunden Kindern (Spearmans ρ = 0,41, n = 115; p < 0,0001) verbunden.

Unser Reaktionsset umfasste nicht die zuvor veröffentlichten Assay-Sets für 19F-Atypical, 19C und 23A; Allerdings haben wir in der In-silico-Analyse keine Hinweise darauf gefunden, dass diese Assay-Sets ihre jeweiligen Ziele nicht erkennen, und diese Assay-Sets haben in anderen Studien gut funktioniert15,29,30. Der Serotyp 23A wurde in unserem Reaktionssatz immer noch mit einem Algorithmus nachgewiesen, der die Ergebnisse des Assay-Sets der Serogruppe 23 (23A/B/F) und der auf Serotyp 23B und 23F ausgerichteten Assay-Sets kombiniert, wobei eine Probe positiv für 23A/ B/F, aber negativ für 23B und 23F, würde 23A zugeordnet.

Während LytA und PiaB in Kombination als empfindlich und spezifisch für den Nachweis von Pneumokokken beschrieben werden und die mit diesen Testsätzen berechnete Dichte übereinstimmend ist, empfehlen Tavares et al.49 seitdem die Verwendung des mutmaßlichen Transkriptionsregulatorgens SP2020 in Kombination mit LytA für eine erhöhte Spezifität. Diese vier Assay-Sets (19F-Atypisch, 19C, 23A und SP2020) sollten weiter validiert und in das Reaktionsset aufgenommen werden, um den Nachweis auf 94 Serotypen, 16 Serogruppen und 59 einzelne Serotypen zu erhöhen. Die Assay-Sets für den Nachweis von E. coli, P. jiroveci, S. agalactiae, dem Xisco-Gen von S. pneumoniae und dem bakteriellen 16S-ribosomalen RNA-Gen wurden in diesem Reaktionsset nicht gut optimiert und dürfen daher nur für verwendet werden qualitative Erkennung von Zielen.

Es bestehen Herausforderungen bei der Unterscheidung innerhalb einiger Serogruppen von einzelnen Serotypen anhand unseres Reaktionssatzes. Dazu gehört, dass ein hohes Maß an Kreuzreaktivität zwischen genetisch ähnlichen Serotypen die Diskriminierung auf Serotypenebene einschränkt. Beispielsweise unterscheiden sich die Serotypen 7A/F und 9A/V genetisch nur durch ein einziges Nukleotid in einer schwer zu erreichenden Region (geringer GC-Gehalt) mit Reihen homogoner Basenpaare, die bei allen hier beschriebenen Hochdurchsatzstrategien zu einem Fehlpriming führen würden2 . Dies erfordert speziellere Strategien, die nicht in unser einheitliches thermisches Profil passen. Darüber hinaus wandeln sich einige Serotypen in situ um und können klinisch möglicherweise nicht einfach in separate Serotypen charakterisiert werden, wie z. B. die Serotypen 11A und 11E, 15B und 15C oder 35B und 35D, die aufgrund eines unvollständigen Verlusts oder Gewinns der Acetylierung in einem „Spektrum“ vorhanden sind Transferasen50,51. Obwohl die beiden letztgenannten Serogruppen molekular unterschiedliche Serotypen enthalten, weisen sie eine problematische klinische Unterscheidung auf und sollten daher mit Vorsicht interpretiert werden.

Zu den weiteren Einschränkungen dieser Studie gehört, dass unsere Methode erfahrene persönliche und spezielle Ausrüstung (Standard BioTools, „Fluidigm“) erfordert, die in vielen Umgebungen nicht erschwinglich ist; Diese Methode kann jedoch problemlos an andere Echtzeit-qPCR-Plattformen angepasst werden. Wenn Serotypen nicht in einzelne Serotypen unterschieden werden, könnte die Bakterienlast für innerhalb von Gruppen nachgewiesene Serotypen überschätzt werden, wenn mehr als ein Serotyp innerhalb einer Serogruppe gleichzeitig übertragen wird, beispielsweise Serogruppe 12A, 12F und Serotyp 44 oder Serotyp 7B , 7C und Serotyp 40. Da die Besiedlung durch die meisten dieser Serotypen in unserem Umfeld nicht hoch ist, ist nicht zu erwarten, dass dies einen sehr relevanten Einfluss hat. Die Unterscheidung dieser Serotypen einzeln wird in Umgebungen wichtig sein, in denen diese Serotypen im Umlauf sind, oder um das Auftreten von Nicht-Impfstofftypen in der Zeit nach der Impfung zu beurteilen.

Die verwendete Standard-Quellung-Methode ist auf den Nachweis von Kolonisatoren mit höherer Dichte und dominanten Kolonisatoren beschränkt, wohingegen unser qPCR „Fluidigm“ mehrere gleichzeitige Kolonisierungen, auch bei geringerer Dichte, nachweisen kann. Dies ist auf die Einbeziehung einer umfassenden Serotypisierungsmethode (Testsätze, die die meisten Serotypen abdecken) und eine hohe analytische Empfindlichkeit zum Nachweis von Kolonisatoren mit geringer Dichte zurückzuführen. Diese Vorteile der qPCR führen dazu, dass bei diagnostischen Vergleichen dieser Methoden die diagnostische Sensitivität und die Übereinstimmung der „Fluidigm“-qPCR im Vergleich zu den kulturbasierten Quellung-Methoden unterschätzt werden, insbesondere wenn die Prävalenz der durch den Referenzstandard nachgewiesenen Serotypen gering ist. Dies war tatsächlich bei den Serotypen 1 der Fall; 7B/C/40; 23A; 29; 33B und 35A/C/42.

Eine weitere Einschränkung für den diagnostischen Vergleich in unserer Studie ist die Verwendung retrospektiver Proben, die mehreren Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen wurden und etwa 10 Jahre lang gelagert wurden, was die Fähigkeit jeder diagnostischen Methode zum genauen Nachweis von Krankheitserregern beeinträchtigen kann. Die Quellung-Methode wurde 2010 (kurz nach der Probenentnahme) durchgeführt und erkannte weitere 9,3 % der Serotypen, die durch „Fluidigm“ qPCR nicht erkannt wurden. Im Gegensatz dazu wurde die analytische Sensitivität und Spezifität der „Fluidigm“-qPCR im gesamten Reaktionssatz nachgewiesen, wenn neu vorbereitete Kulturen oder gBlock-Kalibratoren verwendet wurden. Darüber hinaus konnte das qPCR-Reaktionsset „Fluidigm“ 39,1 % mehr Serotypen erkennen, die von Quellung übersehen wurden. Hier war die Dichte (GMD) der durch „Fluidigm“ qPCR nachgewiesenen zusätzlichen Serotypen etwa doppelt so niedrig wie bei Serotypen, die durch „Fluidigm“ qPCR und Quellung übereinstimmend nachgewiesen wurden, und die meisten (72,6 %) waren subdominante Serotypen, die weniger wahrscheinlich wären mit der Quellung-Methode nachgewiesen werden. Dennoch war unsere Methode in der Lage, die 1.973 ausgewählten Proben im Vergleich zu Quellung mit guter Konkordanz und Empfindlichkeit zu serotypisieren.

Die Verwendung der qPCR-basierten Serotypisierung beruht auf der Erkennung kurzer Zielsequenzen innerhalb eines größeren Kapsel-Polysaccharid-Synthese-Locus, um Serotypen zuzuordnen. Die aktuelle Beschreibung von Serotyp-14-ähnlichen Pneumokokken verdeutlicht die Einschränkung kurzer genetischer Identifikatoren. In Papua-Neuguinea wurde vier NPS-Isolaten von hospitalisierten Kindern mit akuter Infektion der unteren Atemwege durch qPCR der Serotyp 14 (eine invasive VT) zugeordnet. Diese Isolate waren mit den Methoden Quellung, Latexagglutination und PneumoCaT „nicht typisierbar“ (nicht eingekapselt). Die Autoren beschreiben ein abweichendes serologisches Profil und die Fähigkeit, trotz teilweiser genetischer Ähnlichkeit der durch den Impfstoff hervorgerufenen Immunität gegen den Kapselserotyp 14 zu entgehen. Die genomische Sequenzierung der 14-ähnlichen Isolate ergab Mutationen, die die Kapselbiosyntheseorte unterbrechen, wohingegen die kurze, durch PCR gezielte Serotyp-14-Sequenz intakt war52. Darüber hinaus sind kleine Veränderungen innerhalb der Zielsequenzen, wie z. B. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), mit Standard-qPCR-Methoden nicht leicht zu erkennen, wohingegen diese punktuellen genetischen Veränderungen die Kapselstruktur verändern können, wie beispielsweise die Serotypen 6A und 6B53. Die Schlussfolgerung aus diesen beiden Beispielen ist, dass die molekulare Serotypisierung in manchen Fällen möglicherweise keine Antigendiversität oder neue Serotypen identifiziert und alternative Serotypisierungsmethoden verwendet werden sollten, um Diskrepanzen zu beheben.

In 7,8 % der Proben, in denen sowohl LytA als auch PiaB nachgewiesen wurden, wurde kein Serotyp nachgewiesen. Im Rahmen unserer Methode kann der unterschiedliche Nachweis von Pneumokokken und Serotypen auf das Vorhandensein von nicht typisierbaren (NT) Pneumokokken oder, was weniger wahrscheinlich ist, auf Serotypen hinweisen, die nicht in unserem Reaktionssatz enthalten sind. In weiteren 3,8 % der Pneumokokken-positiven Proben lag der Unterschied in der Pneumokokkendichte und der Gesamtserotypdichte über dem oberen Konfidenzintervall des Bland-Altman-Diagramms, was eine nützliche Strategie zur Identifizierung von NT-Pneumokokken sein könnte, die in Co-Kolonisierung mit vorhanden sind andere Serotypen. Diese Methode zum Nachweis von NT-Pneumokokken in Co-Kolonisation unter Verwendung der Konfidenzintervalle der Bland-Altman-Diagramme würde jedoch das Vorhandensein von NT in geringerer Dichte unterschätzen.

Eine Einschränkung unserer Methode besteht in der Erkennung von Kapselserotyp-Zielregionen, die von im Nasopharynx vorhandenen Nicht-Pneumokokken-Arten erworben wurden. Wir haben zwar aufgenommen, dass die Proben sowohl für LytA als auch für PiaB positiv sein müssen, wenn Homologe von Nicht-Pneumokokken-Serotypen in Co-Kolonisation mit echten Pneumokokken-Serotypen vorhanden sind, würden diese jedoch als Pneumokokken-Serotypen zugeordnet. Ein Beispiel für dieses Phänomen ist Streptococcus mitis, der eine Serotyp-1-Kapsel exprimiert54. In Ziel-Assay-Sets, in denen die qPCR-Konkordanz mit Quellung unter Verwendung von Cohens Kappa (Serotypen 1; 5; 7A/F; 11B/C; 12A/F/44; 23A; 11B/C; 29; 33A) als schlecht, mittelmäßig oder mäßig bewertet wurde /F; 35A/C/42; 35F und 38) war dies auf den Nachweis dieser Serotypen in zusätzlichen Proben durch qPCR zurückzuführen. Wenn diese zusätzlichen Serotypen bei der Co-Kolonisierung entdeckt werden, können wir nicht ausschließen, dass es sich immer um echte Pneumokokken handelt. Im Bland-Altman-Diagramm für die Übereinstimmung zwischen der durchschnittlichen Pneumokokkendichte und der Serotypendichte, bei dem die Gesamtdichte mehrerer gleichzeitig kolonisierender Serotypen höher war als die Gesamtdichte der Pneumokokken und außerhalb der unteren Grenze des 95 %-KI lag, kann dies auf das Vorhandensein von Nicht-Serotypen hinweisen -Pneumokokken-Serotyp-Homologe. Hier schlagen wir vor, bei Bedarf zusätzliche Sequenzierungsanalysen zur Bestätigung von Serotypen bei der Co-Kolonisierung durchzuführen, bei denen andere nicht-Pneumokokken-Streptokokken nachgewiesen werden.

Einer der großen Vorteile unserer Studie ist die Beschreibung der Leistung pro Assay-Set gemäß den Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente (MIQE)-Richtlinien55 und der großen Probengröße von Quellung-serotypisierten Isolaten, die für die Validierung unserer Studie zur Verfügung stehen Methode.

Obwohl die Einrichtung des Reaktionssatzes innerhalb der qPCR-Plattform „Fluidigm“ von Standard BioTools anfänglich teuer ist, gehören zu den Vorteilen eine erhebliche Reduzierung der Arbeitskosten und der Wartezeit aufgrund der hohen Anzahl von Datenpunkten, da viele Proben gegen viele verschiedene getestet werden Serotypen verlaufen innerhalb einer Platte. Unsere Methode ist relativ schnell durchzuführen und kann innerhalb eines Tages Ergebnisse für 92 Serotypen und 15 bakterielle Ziele für 180 Proben (zwei IFC-Läufe) liefern. Die Kosten pro Nasopharynx-Probe betragen etwa 36 US-Dollar, was angesichts der umfassenden Serotypisierung und quantitativen Informationen, die pro Probe generiert werden, äußerst günstig ist. Der verkettete Reaktionssatz innerhalb der Standard-BioTools-qPCR „Fluidigm“ wird bei großen Transportstudien von Vorteil sein. Die Methode sollte für andere klinische Proben wie Blut, Sputum, Liquor und andere Stellen, an denen Pneumokokken gefunden werden können, weiter validiert werden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze und die Stata-Codes sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Wir möchten dem South African Medical Research Council/Wits Rural Public Health and Health Transitions Research Unit (Agincourt) danken, der die ursprünglichen Probensammlungen in Agincourt ermöglicht hat. Ebenso danken wir den Mitarbeitern der HIV-Kliniken des Chris Hani Baragwanath Academic Hospital und der Baby-Wellness-Kliniken in Soweto. Wir danken dem National Institute of Communicable Diseases in Südafrika, wo die kulturbasierte Quellung-Serotypisierung ursprünglich durchgeführt wurde. Wir danken auch allen Teilnehmern aus den Einschreibungen Agincourt und Soweto, die Proben beigesteuert haben.

Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation [Fördernummer: OPP1189378] unterstützt. Es gab teilweise Unterstützung vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie und der National Research Foundation: South African Research Chair Initiative in Vaccine Preventable Diseases; und der South African Medical Research Council. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

South African Medical Research Council, Forschungseinheit für die Analyse von Impfstoffen und Infektionskrankheiten, Fakultät für Pathologie, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Universität Witwatersrand, Johannesburg, Südafrika

Sarah L. Downs, Shabir. A. Madhi, Lara der Merwe, Martha. C. Nunes & Courtney P. Olwagen

Department of Science and Technology/National Research Foundation, South African Research Chair Initiative in Vaccine Preventable Diseases, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, University of the Witwatersrand, Johannesburg, Südafrika

Sarah L. Downs, Shabir. A. Madhi, Lara der Merwe, Martha. C. Nunes & Courtney P. Olwagen

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SLD, SAM, MCN und CPO konzipierten und gestalteten die Studie und akquirierten die Finanzierung. SLD war für das Design des Reaktionssatzes verantwortlich, SLD und CPO waren für das gBlock-Design verantwortlich. SLD und LvdM führten die Experimente und die qPCR-Analyse durch. SLD führte die statistische Analyse durch. SLD hat das erste Manuskript verfasst und alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft, dazu beigetragen und es genehmigt.

Korrespondenz mit Sarah L. Downs oder Courtney P. Olwagen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Downs, SL, Madhi, SA, van der Merwe, L. et al. Optimierung einer nanofluidischen Echtzeit-PCR mit hohem Durchsatz zum Nachweis und zur Quantifizierung von 15 Bakterienarten und 92 Streptococcus pneumoniae-Serotypen. Sci Rep 13, 4588 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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Eingegangen: 02. Dezember 2022

Angenommen: 17. März 2023

Veröffentlicht: 21. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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